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海参岩藻聚糖硫酸酯及其酶解产物的制备、结构与活性研究

常耀光

   海参是一种传统海产珍品,营养价值高,生理活性丰富。目前我国海参加工产业虽发展迅速,但水平仍低。对海参活性物质的深入研究,是实现海参精深加工及低值海参高值化的关键科学问题,也是提高海参加工产业整体水平的必由之路。以此为背景,本文以低值参为原料,以海参活性物质中缺乏研究的海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)为研究对象展开探究。 选取四种低值参:海地瓜、白乳参、黑海参及蝶参,提取其体壁中的海参多糖,并以离子交换层析分离纯化出SC-FUC。通过对四种SC-FUC得率、蛋白含量、分子量、单糖组成的分析,确定得率最高(4.07%)的海地瓜SC-FUC作为深入研究的对象。利用凝胶柱层析继续纯化,得到高纯度海地瓜SC-FUC,该多糖仅由岩藻糖组成,分子量为1656.7kDa,硫酸根含量为26.79±3.8%。 酶解法是降解多糖最为理想的方法,限于相应糖苷酶的缺乏,海地瓜SC-FUC之前无法实现酶解。本文以海地瓜SC-FUC为诱导底物,从胶州湾近海海域海水中筛选得到一株海洋细菌CZ1127,经生理生化鉴定及16s rDNA分析确定为黄杆菌科细菌,是首株可利用多种海参来源岩藻聚糖硫酸酯的微生物。CZ1127能够稳定产生海参岩藻聚糖硫酸酯酶(FUCase),该酶主要分泌于CZ1127胞内,经HPSEC、FACE及TLC确认系内切酶。酶学性质研究表示CZ1127 FUCase最适反应温度为28℃,最适反应pH为7.0,热稳定性较差,但4℃下稳定性良好,pH5.5-9.0环境下酶活稳定,Cd2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Hg2+、Cu2+对酶活有抑制,Ca2+、Mg2+对酶活的影响不大。CZ1127FUCase的获取,首次实现了海地瓜SC-FUC的酶解。同时,该酶对于其他多种海参如白乳参、黑海参、仿刺参的SC-FUC亦有降解作用,为国内外首次发现。 以CZ1127 FUCase降解海地瓜SC-FUC,建立海地瓜SC-FUC的可控酶解模型,通过数据拟合,得到一以分子量对数为应变量以加酶量及反应时间为自变量的二元二次方程,回归系数良好。酶解制备寡糖混合物,进而以凝胶柱层析进行纯化,得到六个寡糖纯品,包括三糖、四糖、七糖及八糖。以ESI-MS及ESI-MS/MS解析寡糖片段结构,以1H NMR、COSY、TOCSY、NOESY解析低分子量多糖(SC-LMF)结构,并结合多糖1HNMR信息,综合确定海地瓜SC-FUC主要结构为[→3-α-L-fuc-2,4(OSO3)-1→3-α-L-fuc-1→3-α-L-fuc-1→3-α-L-fuc-1→]n,这是海地瓜SC-FUC的首个结构模型。 采用大鼠模型考察海地瓜SC-FUC的乙醇型胃溃疡预防活性。海地瓜SC-FUC预防乙醇型胃溃疡活性的量效关系显著,剂量达100mg/kg bw(连续灌胃5天)可明显抑制胃溃疡发生,溃疡抑制率为66.53%。500mg/kg bw海地瓜体壁干粉溃疡抑制率达69.44%,海地瓜SC-FUC是海地瓜抗胃溃疡作用的功效成分。通过组织切片观察、化学指标测定及western blotting分析,阐明海参SC-FUC及海地瓜粉的作用机理包括抗氧化、抑制胃粘膜基质水解、抗炎等多个方面。 SC-FUC的乙醇型胃溃疡预防活性与其分子量密切相关。利用CZ1127FUCase将海地瓜SC-FUC降低至适当分子量,可显著提高多糖原有活性。508kDa及54kDa SC-LMF 100mg/kg.bw给药1次起到的预防作用优于原始多糖同剂量给药5次的效果。乙醇型胃溃疡预防活性的阐明,为SC-FUC及SC-LMF的应用提供了崭新的方向,也突显了CZ1127 FUCase良好的应用前景。 综上,本文以海地瓜SC-FUC为研究对象,获得了海洋细菌来源的海参岩藻聚糖硫酸酯酶,实现了海地瓜SC-FUC的首次酶解,建立了海地瓜SC-FUC可控酶解模型,纯化得到了酶解系列寡糖片段,解析了海地瓜SC-FUC的结构,证实了海地瓜SC-FUC的乙醇型胃溃疡预防活性,并进一步通过酶解改性提高了其功效。本文以SC-FUC酶解为关键点及主要创新点,是首个关于海参岩藻聚糖硫酸酯酶解产物的研究。本文结果为海参岩藻聚糖硫酸酯的开发利用提供了理论基础,并有望促进海参精深加工及低值海参高值化利用的发展。……   
[关键词]:海参;海地瓜;海参岩藻聚糖硫酸酯;岩藻聚糖硫酸酯酶;结构;乙醇型胃溃疡
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年