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基于TGF-β1与Bcl-2的抗干眼症中药高通量筛选体系的建立

姚小磊

  目的:建立基于TGF-β1与Bcl-2的抗干眼症中药高通量筛选体系,为干眼症防治药物的研究提供一个理想的技术平台。并利用所建立筛选体系对密蒙花小规模中药组分库进行阳性组分筛选,检验所建立筛选体系的实用性,初步考察密蒙花阳性中药组分的分布。 方法:(1)1号筛选体系的构建和评价:首先采用PCR方法从质粒pGL2-control中扩增获得SV40弱启动子,并以其替换质粒pEGFP-N1中的强启动子CMVIE,获得pSV40-EGFP质粒。提取两份pSV40-EGFP质粒,其中一份以XhoⅠ、HindⅢ双酶切获得含有EGFP的质粒骨架,另一份用BglⅡ、HindⅢ双酶切获得含SV40启动子的质粒片段。用T4-DNA连接酶连接含有EGFP的质粒骨架、含SV40启动子的质粒片段及人工合成的4×GCbox基序(具有XhoⅠ、BglⅡ粘端),获得p4GCbox-EGFP质粒,并以pZsGreen1-DR质粒中ZsGreen1-DR片段替换p4GCbox-EGFP质粒中的EGFP片段,最终获取报告质粒p4GCbox-ZsGreen1DR。将p4GCbox-ZsGreen1DR报告质粒转染大鼠泪腺上皮细胞(LGEC),G418筛选后获得TGF-p1反应性报告细胞株LGEC- ZsGreen1DR。培养后加入TGF-β1(12.5ng/ml),通过荧光显微镜观察检测不同时相点LGEC-ZsGreenlDR细胞ZsGreenl-DR的表达。将LGEC-ZsGreenlDR细胞株冻存1个月后,复苏并传代培养1个月,加入TGF-β1,观察不同时相点ZsGreen1-DR的表达情况,据此评价TGF-β1反应性报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR的稳定性。(2)2号筛选体系的构建和评价:XhoⅠ、BglⅡ双酶切已经建立的质粒p4GCbox-ZsGreen1DR,获得含有ZsGreen1DR的质粒大片段骨架。用T4-DNA连接酶连接含有含有ZsGreen1DR的质粒大片段骨架及人工合成的3×p53binding site (p53BS)基序(具有XhoⅠ、BglⅡ粘端),获得报告质粒p3p53BS-ZsGreen1DR。将p3p53BS-ZsGreen1DR报告质粒转染大鼠泪腺上皮细胞(LGEC), G418筛选后获得p53反应性报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR。培养后加入p53(12.5ng/ml),通过荧光显微镜观察检测不同时相点LGEC-ZsGreen1DR细胞ZsGreen1-DR的表达。将LGEC-ZsGreen1DR细胞株冻存1个月后,复苏并传代培养1个月,加入p53,观察不同时相点ZsGreen1-DR的表达情况,据此评价p53反应性报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR的稳定性。(3)密蒙花小规模中药组分库的试探性筛选:以不同溶剂分离联合大孔树脂分离的方法制备密蒙花小规模中药组分库,共含有39种组分,利用所建立的1号体系和2号体系进行筛选,利用24孔板进行荧光平均光密度进行组分筛选。 结果:(1)质粒酶切及DNA测序鉴定结果表明,Sp-1反应性报告基因载体p4GCbox-ZsGreen1DR序列,以及p53反应性报告基因载体p3p53BS-ZsGreenlDR序列符合预期设想,报告质粒构建成功。(2)将报告质粒转染泪腺上皮细胞,经G418筛选后,获得反应性报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR,提取LGEC-ZsGreen1DR细胞基因组DNA进行PCR鉴定,结果表明:1号体系细胞株LGEC-ZsGreen1DR中含有p4GCbox-ZsGreen1DR质粒,2号体系细胞株LGEC-ZsGreen1DR中含有p3p53BS-ZsGreen1DR质粒。反应性报告细胞株构建成功。(3) TGF-β1诱导表达实验结果表明,1号体系加入TGF-β1前及加入TGF-β1在0h时,LGEC-ZsGreen1DR表达荧光的平均光密度为0.008±0.002:在4 h时LGEC-ZsGreen1DR荧光的平均光密度为0.164±0.044;在12h达到高峰,平均光密度为0.495±0.024;在24h时细胞平均光密度明显下降,平均光密度为0.245±0.055。 将LGEC-ZsGreen1DR细胞株冻存30天,复苏并传代培养1个月,加入TGF-β10h时,LGEC-ZsGreenlDR表达荧光的平均光密度为0.007±0.001;4h后LGEC-ZsGreenlDR的平均光密度为0.144±0.052;12h时的平均光密度为0.387±0.084;24h时的平均光密度为0.188±0.034:说明LGEC-ZsGreenlDR细胞株经冻存、复苏、传代后仍能有效反映TGF-β1对Sp-1的诱导激活作用。 (4)p53诱导表达实验结果表明,2号体系加入P53前及加入P53在0h时,LGEC-ZsGreenlDR表达荧光的平均光密度为0.010±0.003;加入P53在4h时LGEC-ZsGreenlDR的平均光密度为0.134±0.023;在12h达到高峰,平均光密度为0.401±0.124;在24h时细胞平均光密度明显下降,平均光密度为0.149±0.045。 将LGEC-ZsGreenlDR细胞株冻存30天,复苏并传代培养1个月,加入P53在0h时,LGEC-ZsGreenlDR表达荧光的平均光密度为0.007±0.001;加P53诱导4 h后LGEC-ZsGreenlDR的平均光密度为0.144±0.052;12 h时的平均光密度为0.387±0.084;24h时的平均光密度为0.188±0.034;说明LGEC-ZsGreenlDR细胞株经冻存、复苏、传代后仍能有效反映P53的诱导激活作用。 (5)经过溶剂分离和大孔树脂分离之后,实际得到39种中药组分,将所得到的各层次中药组分进行系统的相应编号,利用所建立的1号体系和2号体系进行筛选,各进行了4块24孔板的初筛和1块24孔板的复筛。1号体系筛选出的阳性中药组分编号为:2-2、2-2-3、2-2-4,复筛的平均光密度值分别为:0.213±0.034、0.315±0.079、0.222±0.034;2号体系筛选出的阳性中药组分编号为:2-2-3、2-2-4,复筛的平均光密度值分别为:0.174±0.035、0.158±0.042。 结论:1.成功构建了以Sp-1顺式作用元件4×GCbox基序为增强子、以SV40为启动子,以ZsGreen1-DR为报告基因的真核表达载体p4GCbox-ZsGreen1DR。并将其转染LGEC细胞,经G418筛选后,获得了Sp-1反应性报告细胞株LGEC-ZsGreen1DR,即基于Sp-1的抗干眼症药物高通量筛选体系(1号筛选体系)。 2.成功构建了以p53顺式作用元件3×p53BS基序为增强子、以SV40为启动子,以ZsGreen1-DR为报告基因的真核表达载体p3p53BS-ZsGreen1DR。并将其转染LGEC细胞,经G418筛选后,获得了p53反应性报告细胞株LGEC-ZsGreenlDR,即基于p53的抗干眼症药物高通量筛选体系(2号筛选体系)。 3.经TGF-β1和p53诱导表达实验证实,LGEC-ZsGreen1DR报告细胞株可通过荧光强弱变化敏感地监测Sp-1和p53的活性改变,从而反映外源性物质对TGF-β1、bcl-2的效应,据此可进行抗干眼症药物的筛选。经冻存、复苏实验证实,1号、2号筛选体系具有可靠的稳定性。 4.成功建立了密蒙花小规模中药组分库,所含组分39种,为后续研究提供了经验借鉴。利用所建立的1号、2号筛选体系和24孔板的初步筛选方法,在密蒙花小规模中药组分库中,筛选出能够促进或拟TGF-β1效应的中药阳性组分3种,组份编号为2-2、2-2-3、2-2-4;筛选出能够抑制p53效应的中药阳性组分2种,组份编号为2-2-3、2-2-4。证明筛选体系有良好的实用性。……   
[关键词]:TGF-β1;Sp-1;GCbox基序;bcl-2;p53;p53结合位点基序;干眼症;不稳定型墨绿色荧光蛋白;密蒙花;中药组分库;高通量筛选
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南中医药大学2010年