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胀果甘草原生质体游离与培养体系的研究

刘昕

  甘草(Glycyrrhiza inflate Batal.)是我省道地中药材之一,也是我国西部荒漠、半荒漠地区重要的固沙植物。由于病害及人们破坏性地挖掘致使野生甘草几乎灭绝。尽管人工大面积栽培甘草,其药效成分含量却远不如野生甘草,故通过育种方法选择高药效成分的甘草就显得极为重要。而甘草小孢子发育过程中的各种败育状况、开花年限较长(3-4年)使其常规育种难以进行。为了今后能够获得细胞融合的优良甘草品系,本试验以胀果甘草为材料,优化了甘草愈伤组织诱导及原生质体游离、培养的技术体系并获得了如下结果。 1.甘草愈伤组织诱导体系的优化 (1)不同NAA及2,4-D浓度对下胚轴、子叶愈伤组织的诱导频率均具有极显著差异,以NAA、2,4-D浓度均为1.5 mg.L-1时获得的下胚轴愈伤组织频率最高,分别为67.83%和67.70%。而在NAA浓度为0.5 mg.L-1, 2,4-D浓度为1.0 mg.L-1时子叶愈伤组织的诱导频率最高,分别为73.33%和66.29%。 (2)不同6-BA浓度对下胚轴及子叶愈伤组织的诱导频率有极显著差异,在与2,4-D组合中,2.0 mg.L-1 6-BA诱导下的下胚轴、子叶愈伤组织频率均最高,分别为87.12%和70.77%;而与NAA组合中,6-BA浓度为0.5 mg.L-1时下胚轴愈伤组织诱导频率最高(74.49%),6-BA浓度为2.0 mg.L-1时子叶愈伤组织频率最高,为74.69%。 (3)不同NAA、2,4-D、6-BA浓度对愈伤组织褐化频率具有显著影响。以1.0 mg.L-12,4-D和1.5 mg.L-1 NAA的下胚轴愈伤组织的平均褐化率最低,分别为38.53%和25.42%,另外,1.5 mg.L-1和1.0 mg.L-1 6-BA浓度可有效控制下胚轴和子叶愈伤组织的褐化,其褐化频率仅为40.71%和44.80%。 (4)根据外源激素对愈伤组织诱导率和愈伤组织褐化率的交互效应,获得供试范围内胀果甘草下胚轴和子叶愈伤组织诱导的最佳培养基配方为:MS+1.5 mg.L-1 NAA+0.5 mg.L 16-BA和MS+2.5 mg.L-1 NAA+0.5 mg.L-1 6-BA。 2.甘草下胚轴、叶片和愈伤组织原生质体游离体系的建立。 (1)纤维素酶对原生质体游离的影响大于果胶酶,国产纤维素酶溶解度和解离效果均好于进口纤维素酶,且在2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶的酶液组合中下胚轴、叶片、愈伤组织的原生质体产量和活力最高,分别为1.44×105个.g-1、72.8%;1.25×105个.g-1,70.5%和1.1×105个.g-1,69.4%。 (2)幼嫩的下胚轴、接种10-15d的叶片和继代培养5次的愈伤组织均可获得一定量的原生质体;而无糖MS培养基上生长5d的下胚轴和苗龄11d的叶片是游离原生质体的最佳材料,原生质体产量和活力分别达1.19×105个.g-1,65.2%;1.02×105个.g-1,61.16%。愈伤组织以继代5次后进行原生质体游离为佳,但产量和活力均低于下胚轴和叶片,仅为8.64×104个.g-1,58.84%。 (3)预处理对愈伤组织的原生质体游离有显著影响,热处理(30℃)效果好于冷处理(4℃),以处理8h的愈伤组织原生质体的产量最高,达1.08×105个.g-1。另外,采用先静置酶解材料12h,后摇床(40r.min-1)处理材料30 min的酶解方式可获得较高产量的原生质体。 3.原生质体培养 不同培养基配方、培养密度和培养方式对原生质体分裂有显著的影响。在KM8P培养基中,以0.3mol.L-1蔗糖为碳源,采用看护培养方式,培养密度为1×105个.g-1时,原生质体分裂的时间早,频率高。……   
[关键词]:胀果甘草;愈伤组织诱导;原生质体游离;原生质体培养
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:甘肃农业大学2010年