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降解丝素放线菌的分离鉴定、发酵条件优化及其降解机制研究

王冰

  桑蚕(Bombyx mori)蚕丝作为一种优良的天然蛋白质纤维,长期以来一直被人们广泛地应用于纺织服装行业。近年来,随着高新技术的迅猛发展和各个行业之间的交叉渗透,蚕丝蛋白尤其是丝素的特殊功用日益引发人们的深切关注。丝素是生物兼容性良好的生物大分子,这使得丝素在生物材料、医药、食品、化工等诸多领域具有极高的应用价值。丝素是一种高分子物质,由于结构的特异性,难于被各类蛋白酶降解成各级多肽和氨基酸而付诸实用。降解丝素的传统方法主要有盐解法、酸解法、碱解法等化学方法,但盐解法只能得到大分子的再生丝素粉,酸解法和碱解法则不可避免地会造成氨基酸的破坏,并且这些方法都需要脱盐、脱酸等复杂的后处理,同时还存在能耗高、污染重等一系列环境问题。因此,采用酶解法生产丝素肽是一种比较理想的方法。但丝素蛋白是一种典型的β-角蛋白,结构非常稳定,很难被普通的蛋白酶降解。充分开发微生物资源,利用微生物酶解决生产中的实际困难,是一个很好的研究思路。为此,本研究从土壤中分离到52株能够降解丝素的放线菌,从中筛选出降解能力特别强的Amycolatopsis decaplanina SA12,在单因素试验的基础上,通过二次回归正交旋转组合试验,得到了丝素降解的最佳发酵产酶条件。在此基础上,利用红外光谱、X-射线衍射、扫描电镜观察、热重分析、机械性能测试、氨基酸分析等一系列手段和技术,对A. decaplanina SA12降解丝素的机制进行了系统的探索,主要结果如下。 1.从不同地域采集土样,并采用多种方法对其进行预处理,经富集培养、梯度稀释和划线分离,筛选到了52株能够在以丝素为唯一碳源和氮源的无机盐培养基上生长的放线菌。对其中18株活性较高的菌株,经形态观察、生理生化指标测定、16SrDNA测序和系统进化树构建等一系列手段,最终鉴定到属。 2.对分离到的高活性丝素降解放线菌A. decaplanina SA12进行了发酵产酶条件的优化。单因素试验包括最佳发酵温度、最佳发酵初始pH值、最佳碳源及最佳碳源的最适浓度、最佳氮源及其最适浓度、金属离子影响等指标,并在此基础上,经二次回归正交旋转组合试验最终得到A. decaplanina SA12的最佳发酵产酶条件。放线菌A. decaplanina SA12在32.5℃,pH8.0,KNO3浓度1.25%,玉米粉浓度1.25%的条件下获得最佳发酵产酶条件。同时证明,Mg~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)对产酶有较大的促进作用,而Hg~+、Cu~(2+)、Fe~(3+)有明显抑制作用。 3.在确定了放线菌A. decaplanina SA12为胞外酶和诱导型酶的基础上,进一步对该菌株的底物作用范围进行了探索。结果表明,该放线菌具有较宽的底物范围,能在无机盐培养基中发酵产酶,降解经过高温灭菌处理和未经高温灭菌处理的丝素蛋白、羽毛角蛋白、羊毛角蛋白和人类头发角蛋白,同时对酪蛋白也具备良好的降解作用,暗示该放线菌所产蛋白酶有着较为广阔的应用前景。但A. decaplanina SA12对经过高温灭菌处理的各类角蛋白,较未经高温灭菌处理的同种蛋白具有更好的降解效果,表明酶解进行之前的高温灭菌过程引起的蛋白质变性能够大大加强微生物的酶解作用。 4.经扫描电镜观察,A. decaplanina SA12降解丝素前期,放线菌在丝素表面首先形成一层致密的菌膜结构,并随着时间的推移在菌膜上形成菌落。推测该特殊结构对不溶于水的丝素而言,破坏了造成丝素被蛋白酶解的最大障碍——丝素蛋白分子内和分子间的大量二硫键联结,使得放线菌A. decaplanina SA12能够较为高效地分解利用丝素蛋白。另外,通过扫描电镜观察,放线菌发酵对于丝素蛋白的降解,较少出现孔隙和裂痕,更多地表现为各种不同断口类型。 5.A. decaplanina SA12降解利用丝素,最灵敏的标志指标是机械性能,尤其是反应丝素纤维强度和弹性的拉伸强度、拉伸模量及延伸率指标。从丝素蛋白降解的第2d到第4d,各项机械指标出现了崩溃性变化,拉伸强度从第2d的25.23±5.7 MPa迅速降低到第4d的2.11±0.51 MPa;拉伸模量从第2d的175.55±28.34 GPa,迅速下降到了第4d的18.86±7.49 GPa。 6.利用红外光谱和X-射线衍射技术,结合计算机对试验数据的处理,对A. decaplanina SA12降解丝素过程中蛋白质二级结构的变化进行了定量描述。结果证明,丝素发生微生物酶解过程中,稳定态的β-折叠构象和SilkⅡ结晶形式,其相对数量都存在逐步减少的趋势,但同时存在波动。这说明,丝素酶解是一个动态进程,因受溶液培养基中无机盐离子、微生物恒温振荡发酵培养过程中的剪切力以及降解液中极其复杂的氢键的断裂与重组等诸多因素的影响,构象之间以及不同结晶形式之间一定范围内的动态变换,是一个必然的正常过程。 7.菌株A. decaplanina SA12的丝素降解液中,游离氨基酸的含量在反应的第6d开始陆续出现。最先出现有反应丝素蛋白基本组成的小侧链氨基酸残基甘氨酸和丙氨酸,但另一主要组分丝氨酸出现的水平显著低于丝素中的实际含量,说明A. decaplanina SA12酶解丝素的酶切位点可能位于甘氨酸与丙氨酸之间。同时,作为丝素蛋白水解标志的天门冬氨酸,也在第6d较早的出现在水解液中。 8.角蛋白降解溶液中含硫化合物的动态变化规律以及外来含硫物质对蛋白酶解进程的影响,是一些研究者在探讨角蛋白酶酶解机制时采用的一种有效手段。本研究结果表明,丝素在A. decaplanina SA12培养液中,第1d硫酸盐的释放量即达到最高值。通过对于酶解液中蛋白酶酶活、可溶性蛋白含量及丝素降解率的研究结果,证明在酶活检测得到之前,溶液中丝素降解已经出现,可溶性蛋白增加。这说明关于丝素蛋白,的确存在先于蛋白酶出现的“非酶降解机制”,大量硫酸盐在第1d的出现应该与扫描电镜观察中非常明显的包被丝素纤维的菌膜存在一定联系。A. decaplanina SA12对丝素的降解是非酶降解发生在前,蛋白酶降解发生在后,非酶降解与蛋白酶酶解协同作用的结果。非酶降解破坏了维持丝素蛋白高级形态、造成水解障碍的二硫键联结,是丝素降解过程中最为关键的环节。……   
[关键词]:丝素;稀有放线菌;分离鉴定;发酵;构象变化;降解机制
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东农业大学2009年