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牛支原体PCR检测方法的建立及临床应用

李彦芹

  牛支原体(Mycoplasma bovis)主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜炎、结膜炎等。还可引起一系列的生殖系统疾病。患支原体肺炎的犊牛死亡率较高,而经治疗后症状缓解的牛一般发育迟缓,甚至成为废牛,并严重影响牛奶的产量和质量。给奶牛业带来巨大的经济损失。 2007年,山东部分地区奶牛陆续出现以发烧、呼吸困难为主要特征的病例。该病病程近2个月,共有30头牛不同程度地表现以上临床症状,其中成年牛20头,发病率39.2 %;育成牛4头,发病率57.1 %;犊牛6头,发病率75 %。共死亡1头,死亡率1.5%,淘汰率3头,淘汰率4.5%。结合表现的临床症状及病理剖检和治疗情况,怀疑为支原体感染所致。 采集病牛的肺脏、肝、胸腔渗出物等,接种支原体肉汤培养基,同时剪碎病料呈小块状或直接接取胸腔渗出液,在20%马血清琼脂培养基上划线接种,置5%CO2、37℃温箱中培养,5~7d观察判定。肉汤培养基中生长初期呈轻微浑浊或呈白色点状、丝状生长,以后逐渐均匀浑浊,半透明稍带乳光,不产生菌膜或沉淀,也无颗粒悬浮。在20%马血清琼脂培养基上生长迟缓,为极小的水滴状圆形略带灰色的微细菌落,中央有乳头状突起。姬姆萨染色,显微镜观察,菌落为多形态,以球点状最常见,大小在125~250 nm。 对病牛肺部实变组织进行DNA模板的提取,并分别以牛支原体、无乳支原体、丝状支原体等为阳性对照,利用支原体通用引物扩增其16SrRNA,建立了扩增16S rRNA序列进行支原体检测的方法,扩增到16S rRNA的基因片段,大小为1.5kb左右,经过测序,并与GenBank公布的支原体16S rRNA基因序列进行比较,分别与几种支原体阳性样本的序列同源性均在97~100%。 支原体的培养困难,生长周期长,营养条件苛刻,使其不能作为早期、快速的检测方法。PCR技术为DNA体外扩增技术,呈2n放大效应,可检测样品中微量级的DNA,具有高灵敏性,因此适于早期检测。本研究对导致牛支原体病的丝状支原体丝状亚种、牛支原体、无乳支原体和绵羊肺炎支原体设计了4对特异引物,建立了多重PCR方法,以期达到快速检测的目的,试验具有特异性强,敏感性高的特点,为临床检测提供了强有力的技术支持,为临床疑似支原体感染病例的鉴别诊断提供较有效的快速诊断方法。……   
[关键词]:;肺炎;支原体;聚合酶链式反应
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2009年