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弗氏链霉菌S.fradiae S-221角蛋白酶基因的异源表达及酶学性质研究

李明珠

   本文主要研究了来源于弗氏链霉菌S.fradiae S-221的角蛋白酶基因的克隆和表达及蛋白酶纯化、酶学性质和酶底物切点的分析。1、角蛋白酶基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌S. lividans TK24中的表达。其中,去除链霉菌外分泌信号肽(38aa)编码区的角蛋白酶原序列的基因命名为sfk,其在人肠杆菌的表达中以包含体的形式存在;而角蛋白酶成熟酶(191aa)带有一段N端前导肽(78aa)以及链霉菌外分泌信号肽(38aa)的基因命名为sfks,其在变铅青链霉菌S. lividansTK24中获得成功表达。2、sfks基因获得成功表达后,该异源表达的角蛋白酶通过硫酸铵沉淀、阴离子交换柱和分子筛技术获得纯化,纯化后的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其分子量约为19.1kDa。该纯化蛋白经BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定,其浓度约为27.3μg/ml。3、在pH9.0的Tris-HCl缓冲液中,纯化后的角蛋白酶其最适反应温度为37℃,并能被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制,进一步证明本实验获得的角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶家族;另外,其降解天青角蛋白的活性在加入二硫苏糖醇(DDT)后有极大提高,DDT能够使已发生聚集的晶体蛋白发生分子之间的二硫键解离,从而为角蛋白酶降解天青角蛋白底物提供了方便。同时,在酶活性方面的研究中,酪蛋白、弹性蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和大青角蛋白作为可被降解的底物。4、为了进一步进行底物酶切位点的研究,绿色荧光蛋白和酪蛋白被角蛋白酶降解后,其降解的肽段通过LC-MS QTOF技术分析。该角蛋白酶可能没有特异性的酶切位点,而是把底物切成肽段,该现象展示了此蛋白酶新的酶切方式,该种新酶切方式的研究意义非常远大。……   
[关键词]:弗氏链霉菌;角蛋白酶;天青角蛋白;绿色荧光蛋白(GFP);肽段
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年
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