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肠道病毒71型荧光RT-PCR检测方法的建立及评价

于贺娟

   目的 肠道病毒71型(Enterovirus 71)是引起手足口病(HFMD)的重要病原,大都是幼儿感染,引起发热,典型症状是在手心、脚心、口腔以及臀部出现多个水泡溃疡。还会引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等神经系统症状,会导致严重的并发症和后遗症,甚至死亡。 EV71经典的诊断方法“金标准”是病毒培养分离。但是这种方法需要几个星期的时间,而且会由于病毒滴度低或者抗原漂移而阻碍。分子生物学方法如PCR技术,以用于特异性的检测EV71核酸,而且被证实比病毒分离方法更灵敏。最近,荧光PCR实验室病毒的鉴定上已得到广泛认可,因为它高灵敏性特异性,能快速检测。通过荧光的发射在扩增反应过程中的实现了实时检测。 随着EV71致的手足口病引起越来越多的关注,迫切需要一种快速而特异的方法检测出EV71,并能与其它肠道病毒鉴别,比如CA16,埃可病毒等。本文建立一种荧光RT-PCR技术,快速、敏感的从临床标本中检测EV71的DNA。 方法 根据GeneBank发表的EV71全基因组序列,设计特异的引物与探针;用RT-PCR扩增出226bp的片段,通过纯化后,转化入PGM-T载体中(TA克隆),构建了重组质粒。PCR鉴定DNA测序证实构建质粒成功。以构建的重组质粒为模板,优化最佳反应条件和反应体系,建立最优化的实时定量PCR方法。评价其灵敏性、特异性和可靠性,并用于检测临床标本,同时与传统RT-PCR和病毒分离检测方法比较评价其应用价值。 结果 1.经TA克隆成功地构建了重组质粒。 2.以重组质粒为模板,确定定量RT-PCR反应体系如下:RT-PCR Buffer 10μl; EX Taq-HS 0.2μl;RT Enzyme Mix 2.0μl;引物0.8μl;探针0.4μl;模板RNA2.0μl总体积为20μl。反应条件:42℃5 min;95℃10sec;95℃5sec,60℃30sec;40cvcles;60℃10 min. 3.方法学的评价结果:绘制了以模板拷贝数为分析指标的定量标准曲线,相关方程为r值为0.994,线性范围较宽(102~108copies/μl1),。敏感性:54份经测序鉴定后,确定为EV71的标本,用构建的荧光RT-PCR法方法检测均为阳性。本方法绝对检测低限(即能被检测到的模板起始拷贝最低数)为102拷贝/μl,传统的RT-PCR检测方法绝对检测低限为104拷贝/μl,提高了100倍。特异性检测结果:CA16、埃可病毒、轮状病毒、乙脑病毒等无特异性扩增。可靠性:不同时间检测同一份标本的变异系数小于11%。 4.对临床标本进行检测,荧光RT-PCR法的检测EV71的阳性率是61.2%。病毒分离法和普通RT-PCR法检测的阳性率分别是是16.4%、52.4%。 结论 本研究建立的肠道病毒EV71-TaqMan荧光定量PCR方法,具有特异、灵敏、快速的特点,适用于由EV71感染引起的手足口病等的实验室诊断。……   
[关键词]:肠道病毒71型;TaqManRT-PCR;手足口病
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年