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父源性HLA-A基因与子痫前期相关性研究

李静

   子痫前期(pre-eclampsia, PE)是妊娠期特有的疾病。它是妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders in pregnancy, HIP)的一种类型,发病率我国为9.4%,国外报道7%-12%。临床上以妊娠20周以后出现血压≥140/90mmHg且尿蛋白≥300mg/24h或(+)为特征,常常累及心、肝、脑、肾等重要器官,造成多脏器功能衰竭。该病严重影响母婴健康,是孕产妇和围生儿发病及死亡的主要原因之一。但是,其病因和发病机制至今尚未阐明,成为当前妇产科领域研究的难点和热点。为此,国内外学者进行了大量的临床观察和实验研究,对其病因和发病机制提出了以下几种学说:①免疫学说;②胎盘滋养细胞缺血缺氧学说;③氧化应激学说;④遗传学说。随着现代生殖免疫学的发展,免疫遗传学说被广泛认可,成为近几年研究的热点。 妊娠可被视为一次成功的同种半异体移植。某些研究发现:子痫前期患者可出现类似于急性器官移植排斥反应的急性血管炎等病理改变。同种移植排斥反应乃是针对同种异体组织抗原所产生的免疫应答,最重要的组织抗原是由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)基因编码的产物,人的MHC称为人类白细胞分化抗原(human leucocyte antigen, HLA),编码基因位于人类6号染色体P21.31,全长3600kb,占人类整个基因组的1/3000,是迄今为止人们发现的最具多态性的基因复合体。该复合体不仅含有多个基因座位(locus),而且同一HLA基因座位具有多个等位基因(allele),各等位基因的频率具有人种、民族和地域的差异。 HLA基因可分为3类:①经典HLA基因,包括经典的HLA-Ⅰ类基因(HLA-A、-B、-C)和经典的HLA-Ⅱ类基因(HLA-DR、-DP、-DQ);②免疫功能相关基因,包括血清补体成分(C2、C4、B因子)编码基因、抗原加工提成相关基因:如抗原肽转运物(transporter associated with antigen processing, TAP)、巨大多功能蛋白酶体(large multifunctional proteasome, LMP)、HLA-DM、HLA-DO等以及非经典HLA-Ⅰ类基因(如HLA-E、-F、-G等)和炎症相关基因(肿瘤坏死因子家族等);③免疫无关基因,包括21羟化酶(CYP21)基因等。 HLA-A基因属于经典的HLA-Ⅰ类基因,其基因位点显示多态性,广泛分布于全身有核细胞表面,是参与抗原提呈的关键分子,也是引发同种移植排斥反应的主要抗原,它将内源性的多肽呈递给CD8+毒性T细胞,与特异性的免疫应答尤其相关。 HLA复合体是紧密连锁的,这些连锁在一条染色体上的等位基因很少发生同源染色体间的交换。在遗传过程中,HLA单倍型作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代。而人是双倍体动物,任何一个个体所携带的两个HLA等位基因必定分别来自父方和母方。带有父方异体抗原成分的胚胎对母体来说是一个移植物,母体免疫系统对此进行识别,并产生免疫应答。正常妊娠时,母体对胎儿形成免疫耐受,对胎儿起保护作用的应答反应增强,对胎儿起排斥作用的应答反应降低。一旦父方抗原发生改变,那么母体产生的具有封闭效应的特异性很强的抗体便失去了保护作用,携带一半父方基因的胎儿就易被母体排斥,从而产生诸如子痫前期之类的免疫性疾病,由此提示:父源性基因可能在子痫前期的发病中发挥重要作用。 目的 本课题在河南省郑州地区汉族子痫前期患者及其配偶和正常晚孕孕妇及其配偶中采集血液样本,借助PCR-SSP技术进行HLA-A等位基因分型,探索父源性HLA-A基因与子痫前期的相关性,以阐明父方免疫遗传学背景与子痫前期发病的关系,并为预测子痫前期发病风险、对高危人群进行早期干预等提供理论和实验依据。 材料与方法 1研究对象 选择2008年10月至2009年3月河南省郑州地区在我院经临床确诊的子痫前期患者及其配偶53对。按照高等医学院校规划教材《妇产科学》第七版的诊断标准确诊病例。孕妇平均年龄为(30.49±5.03)岁,平均孕周为(35.98±3.04)周。随机选择同期在我院产科住院待娩的正常健康孕妇及其配偶51对为对照组。孕妇平均年龄为(29.97±4.80)岁,平均孕周为(37.45±1.51)周。两组孕妇均无原发性高血压、心脏病、肾病、糖尿病及肝病病史,无输血及骨髓移植史,无免疫治疗史。两组孕妇均为汉族,无血缘关系,无异族通婚史。所有研究对象均签署了知情同意书。 2实验方法 2.1标本采集 于无菌操作下分别采集53对子痫前期组孕妇及其配偶和51对正常晚孕组孕妇及其配偶外周静脉血2ml,以3.8%枸橼酸钠抗凝,分组编号后,置-20℃冰箱冻存待检。 2.2基因组DNA提取 采用盐析法。取冰冻全血室温解冻,裂解红细胞后在离心沉淀的白细胞中加入白细胞裂解液,混匀,55℃水浴30min,冷却至室温,经饱和氯化钠盐析后加无水乙醇充分颠倒混匀,见絮状析出,离心,取上清液加入70%的乙醇,洗涤,离心弃上清,室温至干,加无菌三蒸水溶解,用紫外分光光度仪测其含量及纯度。调整DNA浓度至100ng/μl,-20℃保存备用。 2.3 HLA-A基因分型 采用PCR-SSP法。根据1995年公布的HLA-Ⅰ类核苷酸序列,按Bunce等的方法设计24对HLA-A特异性引物。另外设计一对内参照引物,来检测反应体系是否正常进行,内参照引物序列上游为5 -TGC CAA GTG GAG CAC CCA A-3 ;下游为5 -GCA TCT TGC TCT GTG CAG AT-3 。所有引物由上海英骏生物公司合成。PCR的反应体系为25μl,包含基因组DNA1μl、10×buffer缓冲液2.5μl、2mM的dNTP 2.5μl、5μM的HLA-A引物2μl、5μM内对照引物2μl、Taq DNA聚合酶0.7U、无菌三蒸水12.8μl。PCR的扩增条件如下:96℃5min;96℃30s,64℃50s,72℃50s,循环5次;96℃30s,62℃50s,72℃50s,循环5次;96℃30s,60℃50s,72℃50s,循环10次;96℃30s,55℃50s,72℃50s,循环15次;最后72℃延伸10min。取6μl PCR产物直接加入2%的琼脂糖泳槽中,设定电压140V,电流90mA,电泳20min,紫外凝胶成像分析系统下观察并拍照。 3统计学处理 采用SPSS16.0钦件包进行统计学分析。两组间计量资料比较采用单因素方差分析,采用直接计数法计算等位基因频率,两组间等位基因分布的差异采用四格表法进行x2检验或Fisher;精确概率法计算P值,有显著性差异时计算疾病优势比(oddsratio, OR)及95%可信区间(confidenceinterval, Cl), OR值越大,表明危险性越大,与疾病的关联越大。对两组间等位基因频率较高或两组间等位基因频率具有显著性差异者(P<0.05),分析该基因在夫妇间的配伍情况,以α=0.05为检验水准。由于每个患者的HLA-A位点均有两个等位基因,故计算基因频率以总基因数(即患者或对照人数×2)为分母,以等位基因数为分子。 结果 1正常晚孕组和子痫前期组一般临床资料的比较 51例正常晚孕组孕妇和53例子痫前期组孕妇的年龄和分娩孕周差异无统计学意义(P>0.05) 2正常晚孕组和子痫前期组孕妇HLA-A等位基因频率比较 51例正常晚孕孕妇和53例子痫前期孕妇中共检出14个HLA-A等位基因。正常晚孕组孕妇以HLA-A2 (19.61%)、-A24 (15.69%)、-All (14.71%)基因频率最高;子痫前期组孕妇以HLA-A2 (26.42%)、-A11 (16.04%)、-A24 (10.38%)基因频率最高。两组孕妇间HLA-A各等位基因频率差异均无统计学意义。 3正常晚孕组和子痫前期组配偶HLA-A等位基因频率比较 所有受试者配偶共检出13个HLA-A等位基因。正常晚孕组配偶中以HLA-A24 (18.63%)、-A2 (16.67%)、-A11 (13.73%)基因频率最高;子痫前期组配偶中以HLA-A2 (20.75%)、-A11 (15.09%)、-A24 (5.66%)基因频率最高。子痫前期组配偶HLA-A24基因频率低于正常晚孕组(P<0.05),OR=3.050,95%CI(1.236-7.690),差异具有统计学意义,其它各HLA-A等位基因频率在两组配偶间无明显差异。 4正常晚孕组和子痫前期组夫妇HLA-A等位基因配伍频率分析 选择正常晚孕组和子痫前期组等位基因频率较高或两组间比较具有显著差异(P<0.05)的HLA-A等位基因(HLA-A2、-A11、-A24),分析该基因在夫妇间的配伍情况。子痫前期组夫妇均携带HLA-A11基因的频率显著高于正常晚孕组(P<0.05);子痫前期组妇不携带而夫携带HLA-A24基因的频率,显著低于正常晚孕组(P<0.05);子痫前期组夫妇均不携带HLA-A24基因的频率,显著高于正常晚孕组(P<0.05)。 结论 1父方因素在子痫前期的发病中起着重要作用。 2父源性HLA-A24基因可能是子痫前期发病的抗性因子。 3夫妇均携带HLA-A11基因或均不携带HLA-A24基因时,子痫前期的易感性增加。……   
[关键词]:人白细胞抗原-A;子痫前期;基因;多态性;聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年