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AMF基因在食管鳞癌细胞株中的表达及功能初步分析

陆玉成

   食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤的第六位。而我国是食管癌的高发区,尤其以太行山周边的河北、河南及山西的部分地区为重。尽管目前临床已采取了一系列的综合治疗手段,但患者平均5年的生存率仍然较低,分析其主要原因是食管癌的转移性。因此,如何降低食管癌转移的发生率,对于改善食管鳞癌病人的临床治疗效果将会有很大帮助。 1986年,Liotta等在黑色素瘤细胞株的细胞培养基中发现了一种能够刺激小鼠3T3成纤维细胞运动的蛋白质,命名为自分泌运动因子(autocrine motility factor, AMF)。最近研究发现,AMF与其受体结合后,能够刺激细胞运动。目前在口腔鳞癌、胃癌、乳腺癌及肝癌中均发现了它的异常高表达,且其表达水平与肿瘤的淋巴结转移、血管侵润及肿瘤分期等密切有关。但有关AMF在食管鳞癌细胞中侵润转移的研究尚未见报道。因此本研究的主要目的是构建AMF基因的绿色荧光蛋白载体及真核表达载体,分别转染食管鳞癌细胞株,对AMF基因在食管鳞癌细胞株中的表达进行定位,并对AMF基因在食管鳞癌细胞株发生、发展中的作用进行初步研究,为食管鳞癌细胞株的分子靶向治疗提供理论依据。实验结果表明,在转染pEGFP-C1-AMF后,AMF基因在胞质内有表达,表明AMF基因定位于细胞质。此外,Western blotting检测发现与未转染组及pcDNA3.1(+)空载体转染组相比,转染pcDNA3.1(+)-AMF后食管鳞癌细胞株p-cofilin蛋白的表达明显升高,蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05)。说明AMF基因的引入能够明显促进肿瘤细胞的转移,提示AMF基因有可能成为治疗食管鳞癌的一个潜在的分子靶点。 方法 1总RNA的提取及鉴定 根据Invitrogen公司Trizol试剂说明书从人食管鳞癌细胞株中提取总RNA,并鉴定RNA的浓度、纯度和完整性。提取后用50μl无RNase的水溶解。 2 AMF基因的克隆及鉴定 根据GenBank上登录的AMF的cDNA全长序列分别设计引物。以提取的总RNA为模板,RT-PCR根据TaKaRa RT-PCR试剂盒说明书进行。将扩增出的PCR产物分别连接到T载体上,测序。测序结果与GenBank上的AMF基因序列进行比对分析。 3 AMF基因真核表达载体的构建及鉴定 测序鉴定正确的重组质粒用引物对应的酶切位点进行双酶切,回收正确的片段。同样对真核表达载体pcDNA3.1(+)及绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1进行相应的酶切,回收载体片段。用T4 DNA连接酶分别连接上述回收的片段,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,涂板,过夜培养,挑克隆,提质粒,双酶切鉴定。 4转染 食管鳞癌细胞株EC9706、Eca109和EC-1接种于6孔板中培养,按LipofectamineTM2000转染试剂说明书使用真核表达载体及pEGFP-C1-AMF及pcDNA3.1(+)-AMF进行转染,以未转染的细胞、转染空载体pEGFP-C1和pcDNA3.1(+)的细胞作为阴性对照。 5荧光显微镜下观察EGFP-AMF融合蛋白的细胞定位 pEGFP-C1-AMF转染EC9706、Eca109和EC-1细胞24 h后,用显微荧光摄像/照相系统观察EGFP-AMF融合蛋白在食管鳞癌细胞中的定位。 .6RT-PCR检测 应用Trizol试剂提取转染前后细胞总RNA,取2μg总RNA进行逆转录,PCR扩增AMF,以β-actin为内参,每个样本重复3次。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像,Gene Tools软件进行灰度分析并统计学处理。 7Western blotting检测蛋白表达 用蛋白裂解液分别提取未转染,转染空载体pcDNA3.1(+)和重组载体pcDNA3.1(+)-AMF细胞的蛋白,用Bradford法测定蛋白浓度。使用Western blotting法检测三组食管鳞癌细胞株中AMF和p-cofilin蛋白的表达差异,并用Gene Tools进行蛋白相对表达量灰度值分析。上述实验均分别重复三次。应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05有显著性。 结果 1总RNA的鉴定 提取的总RNA完整性好,无降解,RNA的纯度和完整性符合RT-PCR要求。 2RT-PCR的鉴定 RT-PCR结果显示,扩增出的特异DNA条带大小约为1700 bp,与预期结果相符。 3 AMF基因真核表达载体的鉴定 鉴定正确的目的基因与相应表达载体相连后经相应酶切,于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测连接产物,可以分别看到与其长度相符的载体带和目的条带。 4 AMF基因的细胞定位 将空质粒pEGFP-C1和重组质粒pEGFP-C1-AMF分别转染食管鳞癌细胞EC9706、Eca109和EC-1,24 h后荧光显微镜下观察。转染空质粒pEGFP-C1的细胞,绿色荧光分布于整个细胞,而转染重组质粒pEGFP-C1-AMF的细胞,绿色荧光定位于细胞质。 5RT-PCR鉴定 RT-PCR结果显示,与对照组相比,pcDNA3.1(+)-AMF转染株中扩增出AMF基因的目的片段量明显增加,证明AMF基因已成功转入EC9706、Eca109和EC-1细胞。 6真核表达载体瞬时转染食管鳞癌细胞株Western blotting结果 用鼠抗组氨酸标签的抗体作为一抗,山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗进行Western blotting分析,同时用β-actin作阳性对照。结果显示pcDNA3.1(+)-AMF转染株在25-32 KD处有特异条带,证明含有6个组氨酸标签的AMF蛋白已经表达。 与未转染的食管鳞癌细胞株相比,转染pcDNA3.1(+)及转染pcDNA3.1(+)-AMF的食管鳞癌细胞株中p-cofilin蛋白的表达均有增加,具有统计学意义(P<0.05)。 结论 本研究成功克隆了AMF基因片段,通过BLAST分析可知,该基因与GenBank上登录的序列相同;构建包含AMF基因的真核表达载体并转染食管鳞癌细胞;通过绿色荧光蛋白的真核表达载体的转染,证明转入的AMF基因定位于食管鳞癌细胞的细胞质;转染真核表达载体pcDNA-3.1(+)-AMF后,p-cofilin蛋白的表达量明显增加,增强了细胞的运动能力。这为进一步研究其功能奠定了基础。……   
[关键词]:食管鳞癌;自分泌运动因子;丝切蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年