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大肠杆菌苯丙氨酸生物合成的调控研究

刘艳华

   研究目的 1构建苯丙氨酸高产菌株,使之适用于工业化生产,降低甜味剂阿斯巴甜原料苯丙氨酸的成本,进而降低阿斯巴甜的成本。 2搭建大肠杆菌合成代谢基因调控技术平台,为今后改造大肠杆菌芳香族氨基酸代谢通路打下基础,不仅可以用来提高天然产生的芳香代谢物苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸生产的产率和产量,还可以利用代谢工程的手段导入外源基因,用来合成其它芳香族化合物如靛蓝、吲哚乙酸、儿茶酚和奎尼酸及其衍生物等。 材料和方法 以大肠杆菌MG1655为受体菌,以pZE12为载体,对大肠杆菌苯丙氨酸合成代谢通路进行修饰。 1敲除编码酪氨酸分支代谢通路上的关键酶基因tyrA;同时敲除对pheA功能有抑制作用的基因pheL;为了基因调控的方便及消除pheA、aroF的本底表达,同时敲除基因pheA、aroF。 2从E.coli中克隆DAHP合成酶基因aroF、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheA,并将这两个基因串联起来,克隆到pZE12中,再把质粒转入基因敲除菌中进行表达。 3从E.coli中克隆脱氢奎宁酸合成酶基因aroB和莽草酸激酶基因aroL,并将这两个基因串联起来,克隆到表达载体pET22b质粒中,再用酶切连接的手段将串联起来的基因整合到pZE12 pheA-aroF中,再把重组质粒转入基因敲除菌中进行表达。 4从E.coli中克隆磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA和转酮酶A基因tktA,并将其串联起来,克隆到表达载体pET22b质粒中,再用酶切连接的手段将串联起来的基因整合到pZE12 pheA-aroF中,再把重组质粒转入基因敲除菌中进行表达。 结果 1 PCR鉴定结果显示pheL、pheA、tyrA、aroF这四个基因敲除成功。 2 PCR及酶切结果显示:重组质粒pZE12 AF、pZE12 AFLB和pZE12 AFPT构建成功,即pheA和aroF、ppsA和tktA、aroL和aroB基因,两两串联并被成功克隆进质粒pZE12中。 3SDS-PAGE电泳显示:本实验实现了pheA和aroF基因编码蛋白质的高表达,araB、aroL、ppsA和tktA基因编码的蛋白质表达较低。 4与野生型MG1655相比,含有pZE12 AF的工程菌苯丙氨酸的产量提高了13倍,含有pZE12 AFPT的工程菌苯丙氨酸的产量提高了10.3倍,含有pZE12AFLB的工程菌苯丙氨酸的的产量提高了5.1倍。 结论 大肠杆菌苯丙氨酸代谢通路上关键酶基因pheA、aroF, aroL、aroB、ppsA和tktA的过表达,可以显著提高大肠杆菌苯丙氨酸产量,其中以pheA和aroF基因最为明显,ppsA和tktA基因次之。过表达的基因对提高工程菌苯丙氨酸产量影响的关键在于基因所编码的酶蛋白质表达水平要高,且各关键酶基因表达量之间要保持平衡,才能达到碳流的最有效利用,提高苯丙氨酸的产量。……   
[关键词]:芳香族氨基酸;苯丙氨酸;生物合成;串联表达;基因敲除
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:郑州大学2010年