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家蚕小热休克蛋白22.6的克隆表达与功能初步分析

郑碧

   小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类受热处理后诱导产生的蛋白家族。作为重要的分子伴侣,小热休克蛋白参与细胞骨架稳定、细胞迁移、调节细胞的生长与分化,并与细胞抗凋亡有关。 我们从本实验室构建的家蚕cDNA文库中获得了一条序列,全长841 bp,其开放式阅读框(ORF)长度为597 bp,编码198个氨基酸残基,包含一个高度保守的α-crystallin结构域。为了制备抗BmHSP22.6蛋白的多克隆抗体,我们将BmHSP22.6基因克隆到表达载体pET-28a上,成功构建了融合蛋白表达质粒pET-28a-BmHSP22.6。将该重组子转化大肠杆菌BL21 Star(DE3),用终浓度为1 mM的IPTG诱导重组菌成功表达了融合蛋白His-BmHSP22.6,超声裂解发现该蛋白以可溶形式存在。经亲和层析纯化的目的蛋白His-BmHSP22.6作为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该蛋白的多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体效价达1:6400以上,Western blot检测抗体的特异性良好,该抗体符合进行下一步实验的要求。Western blot检测发现,BmHSP22.6蛋白在家蚕蛾时期和五龄幼虫的头、表皮中的表达量最高。我们对家蚕吐丝期幼虫和蛹进行热激实验,提取不同组织的蛋白,采用ELISA半定量法和Western blot法检测不同组织热激处理后的蛋白表达变化情况。细胞免疫荧光实验结果表明,BmHSP22.6蛋白存在于家蚕卵巢细胞BmN的细胞质中,经热激处理后,表达量显著上升。这些为小热休克蛋白抵抗环境压力(比如热刺激)的保护机制提供了很好的解释。研究BmHSP22.6对溶菌酶聚集的影响时,发现不同浓度BmHSP22.6在不同程度上抑制了溶菌酶聚集,说明其具有分子伴侣功能。……   
[关键词]:家蚕小热休克蛋白22.6;原核表达;多克隆抗体;热激;分子伴侣
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江理工大学2010年