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丙型肝炎病毒F抗体血清分布特点及F蛋白的功能研究

王昊鹏

  丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)所引起的丙型肝炎呈全球分布。目前全世界约有1.2亿HCV感染者,且呈增长趋势。HCV可以导致急性、慢性肝炎和肝纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),对人类的健康和生命构成了严重威胁。 丙型肝炎病毒属于黄病毒属,为颗粒状单股正链RNA病毒。HCV基因组全长约9600个核苷酸,分为5’非翻译区(UTR)、一个开放读码框(ORF)和3’非翻译区,编码一个由3000多个氨基酸组成的复合蛋白前体,前体蛋白在翻译同时或翻译后被宿主细胞及病毒自身编码的蛋白酶水解为C~NS5b的10种结构和非结构蛋白。HCV-F蛋白是C基因移码读框后所形成的新基因产物,称之为ARF(alternative reading frame)蛋白。作为HCV基因组中唯一能够编码两种蛋白C基因,目前对其编码的C蛋白的功能研究已比较成熟,而F蛋白的生物学特性及功能研究尚处于起步阶段,并推测其可能具有与C蛋白类似的功能。近年来国外学者在感染HCV的患者血清中发现了HCV F蛋白,其在HCV不同基因型中的高度保守性,提示F蛋白可在患者血清中自然表达,并在HCV生命周期中起重要作用。2003年Boulant在研究HCV 1b型C基因在E.coli内的表达情况时,发现了双移位F蛋白(ARFP/DF),并在患者血清中得到证实。随后国外相关研究表明,DF蛋白具有一定的生物学功能,可能参与肝病进程。目前国内对DF功能的研究甚少。 为了解F蛋白的生物学功能,观察其与C蛋白功能的联系。本研究以肾透析HCV感染者为研究人群。一方面,探讨患者血清中F抗体与C抗体分布之间是否有关联,并研究F抗体的分布与HCV感染慢性化等之间的关系。另一方面,利用Western blot和半定量PCR技术检测表达DF蛋白的HepG2细胞中2种抑癌基因变化,借以推断DF蛋白是否在肝癌发生发展中扮演一定的角色。 第一部分肾透析人群中丙型肝炎病毒F抗体与C抗体分布联系及F抗体分布特点 目的:研究HCV患者血清中F抗体与C抗体分布联系及F抗体分布特点,为F蛋白功能研究提供初步依据。方法:研究对象为江苏省人民医院、省中医院肾透析中心就诊的128例HCV感染者,及对照HCV抗体阴性者100例。将本试验室纯化后的重组表达蛋白HCV(1b)-F/GST作为抗原包被酶联反应板,以GST蛋白孔作为本底对照,C抗原为采购的商业化抗原,ELISA间接法分别检测血清样本。结合患者临床资料,分析F抗体与C抗体分布联系及F抗体分布特点。结果:F抗体与C抗体的分布无差异(P>0.05);半定量分析F抗体滴度显示随年龄增长和丙型肝炎慢性化程度加深F抗体量呈上升趋势,HBV联合感染F抗体量明显高于HCV单独感染;多因素分析F抗体阳性率在年龄、血透时间、HBV联合感染、丙型肝炎临床分期变量分组间存在统计学差异。结论:F蛋白具有一定的生物学功能,其表达与机体环境因素相关。F蛋白可能参与肝病进程,因此开展HCV感染慢性化影响因素研究,有利于阐明中国人群HCV慢性化的可能机理,并对个体化预防和治疗、控制我国人群HCV感染慢性化,具有重要的理论和实践意义。 第二部分丙型肝炎病毒基因1b型双移位F蛋白对抑癌基因的调节作用 目的:探讨丙型肝炎双移位F蛋白(DF)对肝癌细胞抑癌基因p16、p21、转录与表达的影响,分析DF蛋白的功能。方法:PCR扩增HCV 1b型DF基因,构建pcDNA3.0/HCV-DF真核表达载体。再转染至肝癌细胞HepG2中,并G418筛选稳定表达细胞株,流式细胞术检测DF蛋白对HepG2细胞周期影响,半定量RT-PCR法检测p16、p21基因转录及Western blot检测p16、p21蛋白表达,并以pcDNA3.0空质粒作为阴性对照,未转染质粒细胞作空白对照。结果:重组质粒pcDNA3.0/HCV-DF蛋白在HepG2细胞中稳定表达,DF蛋白可以促进HepG2细胞增殖并抑制其凋亡。pcDNA3.0/HCV-DF转染细胞中p16、p21 mRNA转录水平和蛋白表达水平较空质粒转染的细胞明显下降。结论:HCV DF蛋白能够抑制细胞凋亡并抑制抑癌基因p16、p21表达,提示其可能参与肝细胞癌变发生发展。……   
[关键词]:丙型肝炎病毒;HCV基因型;F抗体;C抗体;慢性化;双移位F蛋白;HepG2;抑癌基因;细胞周期;p16;p21
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2010年