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AFB_1代谢相关的CYP450酶的表达及影响因素分析

陆慧媛

  黄曲霉毒素B_1(AFB_1)属于I类强致癌物,主要污染农作物和食物。尽管肝脏一直被认为是AFB_1毒作用的重要靶器官,但也有证据显示AFB_1对人呼吸系统肿瘤的发生起重要作用。AFB_1的致癌作用和其经代谢活化形成活性中间代谢产物epoxide有关,而细胞色素P450(CYP450)酶则是其在体内代谢活化过程中最主要的代谢酶。研究显示,一些CYP450s如CYP1A2、CYP3A4以及CYP2A6与AFB_1的代谢活化有密切关系,其中CYP1A2是公认的人肝脏代谢AFB_1的优势酶。但近年来的研究发现,CYP2A13也可以高效代谢活化AFB_1,生成包括epoxides在内的多种活性代谢产物。鉴于CYP2A13在人呼吸道和肺脏中特异性的高表达,而CYP1A2几乎不在该组织中表达,提示CYP2A13可能与人呼吸系统原位代谢AFB_1并进而引起肿瘤的发生有关。但迄今,有关CYP2A13代谢活化AFB_1的证据尚显不足。因此,以体外代谢为切入点,通过酶反应学和代谢产物分析,进一步确认CYP2A13与AFB_1的关系并寻找重要代谢产物,将为AFB_1诱发人呼吸系统肿瘤提供机理上的依据。 AFB_1的体外代谢反应体系需要大量单一组分、有活性的CYP450蛋白,通过异源表达系统表达纯CYPs,是目前获得单一纯酶的主要方法。异源表达系统中,昆虫细胞的蛋白加工和修饰方式与哺乳动物细胞相似,且表达量高,可以高水平表达多种原始的CYP450蛋白。只是CYP450s活性的发挥需要NADPH-细胞色素P450还原酶(POR)、NADPH等辅酶为其提供电子,单独的表达会阻碍活性的完全发挥。有研究表明,在昆虫细胞中加入辅助因子5-ALA、柠檬酸铁(Fe3+)或Hemin,可表达有活性的CYP450s;此外,CYP450s和POR共表达可得到天然不需再修饰的微粒体膜活性蛋白,从而为体外代谢体系的建立提供较为有效的途径。但由于体外表达CYP450蛋白的复杂性,因此需要对关键影响因子进行系统研究,为体外高效表达CYP450s创造有利条件。 目的 选择Baculovirus/Sf9系统体外表达CYP2A13及其他与AFB_1代谢相关的CYP450和POR蛋白,研究不同辅助因子Hemin、5-ALA和Fe~(3+)对CYP450酶和POR表达效率及活性的影响,并尝试CYP酶和POR的共表达,探寻稳定、高效表达高活性CYP450酶和POR的条件,为进一步构建体外代谢反应体系、系统阐明CYP2A13对AFB_1的代谢活化作用、明确关键的代谢产物提供可靠的研究平台。 方法 使用酶切、酶连方法构建重组转移载体pFastBac1-CYPs质粒并进行酶切和PCR验证;通过转座实验,将CYPs各基因片段插入穿梭载体Bacmid DNA中,构建重组Ac-Bacmid-CYPs,进行PCR验证;使用Ac-Bacmid-CYPs DNA转染昆虫细胞Sf9,在细胞中获得完整的含CYPs基因的杆状病毒;使用含CYPs基因的杆状病毒感染Sf9细胞,加入辅助因子5-ALA和Fe~(3+),表达CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6、CYP2A13和POR蛋白,Western blot检测各蛋白的表达;对CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6和CYP2A13蛋白进行CO差示光谱检测;对POR蛋白进行细胞色素C分析。 在使用Baculovirus/Sf9系统表达CYP450s时,加入不同浓度、不同辅助因子5-ALA、Fe~(3+)、Hemin或其组合,使用Western blot法,细胞色素C还原法和CO差示光谱法检测并评价不同辅助因子对蛋白表达水平和活力的影响。此外,将含CYP1A2或POR基因的杆状病毒按不同比例混合联合感染Sf9细胞进行共表达,寻求最佳比例;在此基础上,初步探讨不同辅助因子5-ALA或(和) Fe~(3+)对CYP1A2和POR共表达的影响,寻找最合适的体外表达条件。 结果 1.经过选择合适正确的酶切位点,通过酶切和连接反应,获得了pFastBac 1-CYPs(POR)质粒并经酶切反应和PCR验证无误;随后成功构建真核表达Ac-Bacmid-CYPs(POR)病毒DNA并进一步获得高滴度的重组真核表达Ac-Bacmid-CYPs(POR)病毒。 2.采用传统条件体外表达CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6、CYP2A13和POR,Western blot检测显示上述蛋白在Baculovirus/Sf9系统中可成功表达,CYP450可出现45-55 kD的条带,而POR的条带出现在约78 kD处;CO差示光谱法检测证实各CYP450s在450nm处都有明显的吸收峰,显示有酶催化活性,每mg微粒体蛋白分别含CYP2A13、CYP2A6、CYP1A2、和CYP3A4蛋白的表达量为0.21nmol、0.057 nmol、0.027 nmol和0.023 nmol。POR蛋白对细胞色素C催化活力为1519.47 Unit/mg微粒体蛋白,且低温存放3个月后活性变化不明显(1505.01 Unit/mg微粒体蛋白)。 3.相对于单独加入5-ALA和Fe~(3+),同时加入0.1mM 5-ALA和0.1mM Fe~(3+)时,CYP1A2蛋白的表达显著提高,分别增加了40%和65%,也比单独加入Hemin时提高了32%;尽管POR的表达可能不需要5-ALA和Fe~(3+)的协助,但加入了5-ALA和/或Fe~(3+)后,POR的表达量显著提高,分别相当于不加时的2.13、1.71和1.86倍,且仅加入5-ALA时表达水平最高;同样的结果也反映在POR的活力上,加入5-ALA和/或Fe~(3+)分别提高7.1倍、4.5倍和5.4倍。不同浓度和种类辅助因子对CYP450酶的活性也有较大的影响,加入0.35mM 5-ALA和0.1mM Fe~(3+)时,CYP2A6的酶活性显著高于其它浓度组别。 4.不同比例的CYP1A2和POR病毒在Baculovirus/Sf9系统中共表达时,对各自蛋白的表达有较大的影响,在CYP1A2和POR病毒比例为2.5:1和3:1时,无论CYP1A2还是POR,其表达量都显著增加,分别比比例为2:1和4:1时提高约50%,且两者的表达比例较为适当;在CYP1A2:POR病毒比例为2.5:1的表达体系中,0.1和0.35mM 5-ALA时,CYP1A2和POR的表达量都显著高于0.6 mM;加入0.1mM Fe~(3+)时,蛋白表达水平也有较高水平;但有趣的是,当联合加入5-ALA和Fe~(3+)时,蛋白的表达量反而下降,相关机制有待进一步研究。 结论 1.采用传统方法可获得一定量和一定活性的CYP450蛋白和POR蛋白,但不同的CYP450的活性差异较大;低温保存较长时间对POR活性影响不大; 2.不同辅助因子对CYP450和POR的表达及活性有明显影响。联合加入5-ALA和Fe~(3+)可显著增加CYP450的表达和活性,但POR略有不同,仅加入5-ALA时,POR的表达和活性明显提高; 3. CYP1A2和POR病毒比例为2.5:1和3:1时有利于两者的表达;低浓度的5-ALA或Fe~(3+)有利于共表达,但联合加入时,共表达效率反而下降。 由上可见,不同的表达条件对于在Baculovirus/Sf9系统中CYP450蛋白的表达和活性有较大的影响,应在实际工作中不断优化,确保稳定高效的表达。……   
[关键词]:细胞色素P450;POR;黄曲霉毒素B1;Baculovirus/Sf9表达系统;辅助因子;共表达;影响因素
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2009年