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JNK/c-Jun信号通路在低浓度亚砷酸钠所致HELF细胞增殖异常和细胞周期紊乱中的作用

徐辉

  砷是自然界分布极广的类金属元素,亚砷酸钠(NaAsO2)是砷元素在环境中主要的存在形式之一。流行病学资料表明,长期摄入砷化物可导致多种癌症发病率升高,如皮肤癌、肺癌、膀胱癌和肝癌等。肺组织是砷对人体产生毒作用的重要靶器官之一,特别是有色金属采矿冶炼工人和含砷农药制造工人长期吸入低浓度无机砷而导致肺癌发病率升高是一种严重危害工人健康的职业病。砷化物虽然是人类确定致癌物,但其致癌的分子机制尚未完全清楚。 研究认为,正常细胞恶性转化的机理之一是致癌因素作用于正常细胞后,引起原癌基因表达过强或/和抗癌基因表达过低、细胞信号转导异常、细胞周期紊乱,从而引起细胞不可控制地过度生长,导致细胞恶性转化,最终产生癌症。其中,正常细胞周期紊乱及其所致的细胞增殖异常是癌症发生的基础。 国内外已有研究报道不同浓度NaAsO2可引起细胞增殖与凋亡的双相效应,即低浓度引起细胞增殖升高而凋亡降低,而高浓度则引起细胞增殖降低而凋亡升高;并发现活性氧(ROS)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在不同浓度NaAsO2所致细胞双相效应中发挥重要作用,但其具体的分子机制尚不清楚。 本研究拟探讨不同浓度NaAsO2对人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞增殖和细胞周期的变化,以及对JNK激活、c-Jun激活和相关周期蛋白cyclin D1表达的影响及其相互关系;并应用JNK特异性抑制SP600125预处理、RNAi技术下调JNK和c-Jun蛋白而阻滞JNK/c-Jun信号通路后再观察低浓度NaAsO2对HELF细胞增殖和细胞周期的影响。从而探讨JNK/c-Jun信号通路在低浓度NaAsO2所致HELF细胞增殖异常和细胞周期紊乱中的作用。 方法 一、不同浓度NaAsO2对HELF细胞增殖和细胞周期的影响 为了解NaAsO2对HELF细胞增殖的影响,分别用0.0、0.1、0.5和5.0μM不同浓度NaAsO2处理HELF细胞12、24和48 h后,CCK-8法检测HELF细胞增殖率;为了解NaAsO2对HELF细胞周期的影响,分别用0.0、0.1、0.5和5.0μM不同浓度NaAsO2处理HELF细胞24 h后,溴化丙啶(PI)染色所收集细胞,流式细胞仪检测细胞周期。 二、不同浓度NaAsO2对cylclin D1蛋白表达水平的影响 为了解NaAsO2对HELF细胞周期素cyclin D1蛋白表达的影响,分别用0.0、0.1、0.5和5.0μM不同浓度NaAsO2处理HELF细胞6、12和24 h后,提取HELF细胞总蛋白,用western blot方法检测cyclin D1蛋白表达水平。 三、不同浓度NaAsO2对JNK/c-Jun信号通路的影响 为检测NaAsO2对HELF细胞JNK/c-Jun信号通路的影响,分别用0.0、0.1、0.5和5.0μM不同浓度NaAsO2处理HELF细胞6、12和24 h后,提取HELF细胞总蛋白,用western blot方法分别检测JNK、磷酸化JNK、c-Jun和磷酸化c-Jun的表达水平。 四、JNK/c-Jun信号通路在低浓度NaAsO2所致HELF细胞增殖异常和细胞周期紊乱中的作用 为探讨JNK/c-Jun信号通路是否参与了低浓度NaAsO2诱导HELF细胞增殖异常和细胞周期紊乱的过程,用20μM JNK抑制剂SP600125预处理HELF细胞30 min或20 nM JNK siRNA和c-Jun siRNA分别转染HELF细胞24 h而阻滞JNK/c-Jun信号通路后,再分别用0.0、0.1、0.5和5.0μM NaAsO2处理HELF细胞24 h,分别用CCK-8法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞周期。 五、JNK/c-Jun信号通路在低浓度NaAsO2诱导cyclin D1蛋白表达升高中的作用 为探讨低浓度NaAsO2是否通过激活JNK/c-Jun信号通路而介导cyclin D1蛋白表达水平升高,用20μM JNK抑制剂SP600125预处理HELF细胞30 min或20 nM JNK siRNA和c-Jun siRNA分别转染HELF细胞24 h而阻滞JNK/c-Jun信号通路后,再分别用0.1和0.5μM NaAsO2处理HELF细胞12 h,收集HELF细胞总蛋白,用western blot方法检测JNK、磷酸化JNK、c-Jun、磷酸化c-Jun和cyclin D1蛋白表达水平。 结果 一、不同浓度NaAsO2对HELF细胞增殖和细胞周期的影响 (一)不同浓度NaAsO2对HELF细胞增殖的影响 HELF细胞相对增殖率在低浓度0.1和0.5μM NaAsO2组处理12、24和48 h时均显著高于对照组(P<0.05或<0.01),其增殖高峰表现在0.1μM NaAsO2组和24 h时间点。而高浓度5.0μM NaAsO2组HELF细胞相对增殖率在不同时间均显著低于对照组(P<0.05)。结果说明低浓度NaAsO2可引起HELF细胞增殖升高,而高浓度NaAsO2则引起HELF细胞增殖降低。 (二)不同浓度NaAsO2对HELF细胞周期的影响 HELF细胞暴露于低浓度0.1和0.5μM NaAsO2组24 h后,G1期细胞比例显著低于对照组(P<0.01),S期细胞比例则显著高于对照组(P<0.01);而高浓度5.0μM NaAsO2组G2/M期细胞比例显著高于对照组(P<0.01)。结果说明低浓度NaAsO2可诱导HELF细胞由G1期向S期跃迁,促进细胞增殖;而高浓度NaAsO2则可引起HELF细胞G2/M期阻滞,抑制细胞增殖。 二、不同浓度NaAsO2对cylclin D1蛋白表达水平的影响 HELF细胞暴露于低浓度0.1和0.5μM NaAsO2组6、12和24 h后,均不同程度地引起cyclin D1蛋白表达水平明显升高;而5μM NaAsO2未引起cyclin D1蛋白表达水平明显升高。结果说明低浓度NaAsO2可引起cyclin D1蛋白表达水平明显升高。 三、不同浓度NaAsO2对JNK/c-Jun信号通路的影响 (一)不同浓度NaAsO2对磷酸化JNK表达水平的影响 HELF细胞暴露于低浓度0.1和0.5μM NaAsO2组6、12和24 h后,磷酸化JNK表达水平明显高于对照组;而高浓度5.0μM NaAsO2未引起JNK磷酸化水平明显升高。结果说明低浓度NaAsO2可不同程度诱导JNK信号通路激活,且变化规律与cyclin D1蛋白表达升高变化基本一致。 (二)不同浓度NaAsO2对磷酸化c-Jun表达水平的影响 HELF细胞暴露于低浓度0.1和0.5μM NaAsO2组6、12和24 h后,均引起c-Jun磷酸化水平明显升高;而高浓度5.0μM NaAsO2未引起c-Jun磷酸化水平明显升高。结果说明低浓度NaAsO2可引起c-Jun激活,其变化规律与JNK信号通路激活和cyclin D1蛋白表达升高基本一致。 四、JNK/c-Jun信号通路在低浓度NaAsO2所致HELF细胞增殖异常和细胞周期紊乱中的作用 (一)JNK/c-Jun信号通路阻滞对低浓度NaAsO2所致HELF细胞增殖异常的影响 HELF细胞相对增殖率在SP600125预处理时低浓度0.1和0.5μM NaAsO2组均显著低于同一浓度无抑制剂处理组(P<0.01),但与自身空白对照组无显著性差别(P>0.05);HELF细胞相对增殖率在转染JNK siRNA和c-Jun siRNA时低浓度0.1和0.5μM NaAsO2组细胞相对增殖率均显著低于同一浓度无siRNA转染处理组(P<0.01),而与空白对照组无显著性差别(P>0.05)。结果说明JNK/c-Jun信号通路在低浓度NaAsO2所致HELF细胞增殖异常过程中发挥重要作用。 (二) JNK/c-Jun蛋白下调对低浓度NaAsO2所致HELF细胞周期紊乱的影响 HELF细胞S期细胞百分比在用20 nM JNK siRNA转染时0.1和0.5μM NaAsO2组明显低于同一浓度未用siRNA转染组(P<0.05),而与其自身对照组无显著性差别(P>0.05);类似地,HELF细胞S期细胞百分比在用20 nM c-Jun siRNA转染时0.1和0.5μM NaAsO2组明显低于未用siRNA转染组(P<0.05),而与其自身对照组无显著性差别(P>0.05);结果说明JNK/c-Jun信号通路参与了低浓度NaAsO2所致HELF细胞周期紊乱过程。 五、JNK/c-Jun信号通路在低浓度NaAsO2诱导cyclin D1蛋白表达升高中的作用 (一)JNK信号通路阻滞对低浓度NaAsO2诱导c-Jun激活和cyclin D1蛋白表达升高的影响 HELF细胞磷酸化JNK表达水平在用SP600125预处理时0.1和0.5μM NaAsO2组均明显低于同一浓度无抑制剂组,磷酸化c-Jun表达水平和cyclin D1蛋白表达水平也明显降低;类似地,HELF细胞JNK蛋白表达水平在用JNK siRNA转染时0.1和0.5μM NaAsO2组均明显低于同一浓度未用siRNA转染组,磷酸化c-Jun表达水平和cyclin D1蛋白表达水平也均明显降低。结果说明低浓度NaAsO2可能通过激活JNK/c-Jun信号通路,从而引起cyclin D1蛋白表达水平升高。 (二)C-Jun蛋白下调对低浓度NaAsO2诱导cyclin D1蛋白表达升高的影响 HELF细胞c-Jun蛋白表达水平在用c-Jun siRNA转染时0.1和0.5μM NaAsO2组均明显低于同一浓度未用siRNA转染组,cyclin D1蛋白表达水平也均随之明显降低,而磷酸化JNK表达水平未受c-Jun siRNA的影响。结果说明低浓度NaAsO2通过激活JNK而激活c-Jun,然后再诱导cyclin D1蛋白表达升高。 结论 1.低浓度NaAsO2可引起HELF细胞增殖升高,而高浓度NaAsO2可引起HELF细胞增殖降低。 2.低浓度NaAsO2可促进HELF细胞从G1期跃迁到S期而引起细胞周期紊乱。 3.低浓度NaAsO2可激活JNK/c-Jun信号通路而引起细胞周期素cyclin D1蛋白表达升高。 4. JNK/c-Jun信号通路和细胞周期素cyclin D1在低浓度NaAsO2所致HELF细胞增殖异常和细胞周期紊乱中发挥重要作用。……   
[关键词]:亚砷酸钠;细胞增殖;细胞周期;JNK信号通路;cyclin D1
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2009年