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弓形虫Prugniaud株慢性感染小鼠保护性免疫机制的研究

赵俊桃

  刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生原虫,也是一种危害严重的人畜共患致病原虫。人体感染弓形虫后,大多数为无症状的隐性感染者,只有当机体免疫功能低下或严重感染时,才会出现临床表现。近年来,随着器官移植、骨髓移植以及艾滋病患者的增多,弓形虫病的发病人数也在逐渐增多,且弓形虫病常常造成严重的的病理损害。 作为一种重要的机会性致病原虫,弓形虫的致病作用与虫株毒力、宿主的免疫状态有关。建立合适的动物模型是深入研究弓形虫感染宿主的免疫机制乃至致病机制的关键所在。根据虫株的侵袭力、繁殖速度、包囊形成与否以及对宿主的致死率等,刚地弓形虫可分为强毒株和弱毒株系。强毒株对常用的任何品系的实验动物小鼠都极为敏感,小鼠腹腔或皮下接种感染后,速殖子可在小鼠体内迅速增殖,若不治疗,可引起急性的致死性感染,不能形成包囊进入慢性感染阶段,因此小鼠常作为弓形虫急性感染的动物模型。但是人类弓形虫自然感染多表现为隐性感染,因此建立弓形虫慢性感染状态的动物模型对人类弓形虫病的研究和防治更具有实际意义。因此,我们在研究中用的是弱毒株系弓形虫Prugniaud株。但是迄今为止国内外对Prugniaud株感染小鼠建模的有关情况却报道很少。 弓形虫感染宿主后的后果取决于宿主和虫体之间的相互作用。虫体方面主要和虫株的类型和传代次数有关。宿主方面,一直被认为是机体抵抗弓形虫感染的细胞免疫是人体主要的抗弓形虫感染的保护性免疫,它在抑制虫体繁殖、防止包囊活化、清除虫体、控制虫血症等方面起重要作用。与弓形虫感染免疫相关的细胞因子包括免疫上调因子和免疫下调因子。免疫上调因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α等)主要由Th1细胞及MФ产生;免疫下调因子(IL-4、IL-6、IL-10等)则主要由Th2细胞产生。在弓形虫不同感染时期,免疫上调因子和免疫下调因子的表达水平及出现时间有所不同。另外同某些病原体一样,弓形虫在感染过程中会诱导机体产生短暂的免疫抑制,这种免疫抑制被认为是弓形虫的一种逃避宿主防御系统攻击的保护性机制。 近年来,随着一群具有抑制功能的CD4~+ CD25~+调节性T细胞的发现和被深入研究,越来越多的证据表明此群细胞在调节病原体感染免疫中起重要作用。研究发现它们可在一定程度上通过限制对感染部位的免疫应答的敏感性来抑制过度的免疫应答,从而导致病原体的长期存在。在硕大利什曼原虫感染中,CD4~+ CD25~+调节性T细胞可通过抑制易感鼠Th2应答或是抗性鼠的Th1应答使机体避免产生过强的免疫反应,也可使寄生虫易于存活。 基于国内外对弓形虫Prugniaud株的研究现状和弓形虫感染后的免疫特征。本研究拟从三方面进行探索:第一:探讨建立弓形虫Prugniaud株慢性感染小鼠模型的条件;第二:初步探讨引起对该株易感小鼠急性感染死亡的免疫学因素;第三:利用建立的慢性感染小鼠模型,研究CD4~+CD25~+ T细胞在弓形虫慢性感染小鼠免疫抑制和免疫平衡方面的作用,从新的角度探讨慢性感染弓形虫后保护性免疫机制。 目的: 建立弓形虫Prugniaud株慢性感染小鼠模型,初步探讨对此株易感小鼠急性感染死亡的免疫学因素,研究弓形虫慢性感染后的相关免疫学保护机制。 方法: 1、参考文献纯化弓形虫包囊的方法并加以改良,用淋巴细胞分离液高速离心法纯化包囊,并通过镜检和接种小鼠来鉴定包囊的纯度和活性。 2、采用腹腔注射包囊的感染方式,用不同的感染剂量感染C57BL/6、BALB/c和ICR三种品系小鼠(C57BL/6、BALB/c均分5个包囊/只小鼠组和10个包囊/只小鼠组2组,ICR分5个包囊/只小鼠,10个包囊/只小鼠和20个包囊/只小鼠3组)对比不同品系小鼠对弓形虫Prugniaud株的易感性,观察小鼠感染后状态、生存期和病理特征。 3、在生存期内(包括小鼠急性发病濒死期)检测3种小鼠(C57BL/6、BALB/c和ICR小鼠)脾脏单个核细胞中Th1与Th2细胞的比例动态变化。同期小鼠肝、肺、脑组织提取DNA做弓形虫特异引物PCR扩增验证小鼠感染成功。 4、利用建立的弓形虫Prugniaud株慢性感染ICR小鼠模型,检测感染前和感染后1w、2w、3w、5w脾脏单个核细胞中Th1型、Th2型和CD4~+ CD25~+调节T细胞占CD4~+ T细胞的比例;同期小鼠脑组织一半用于匀浆包囊观察,一半用于制备小鼠脑组织病理切片。 结果: 1、参考文献方法并加以改良后,纯化出的包囊镜下观察纯度较高,接种易感品系小鼠可致小鼠短期内发病死亡。 2、采用腹腔注射10个包囊/只小鼠或5个包囊/只小鼠感染BALB/c和C57BL/6小鼠均可使两种小鼠在感染后8 d左右发病并且90 %左右小鼠发生急性感染死亡,而ICR小鼠感染5个包囊/只小鼠、10个包囊/小鼠或20个包囊/只小鼠时均可较稳定地度过急性感染期,只有约10 %左右小鼠发生死亡。 3、三种小鼠在接近发病濒死期均具有较高比例的Th1型细胞。 4、在整个实验期中,免疫抑制期(Th1下调期)是CD4~+ CD25~+调节T细胞的比例最高峰。在小鼠症状明显的急性感染期,小鼠脑组织并没有很严重的病理损伤。 结论: 1、通过对文献方法进行改良后的弓形虫包囊纯化法,可以成功分离小鼠脑组织匀浆弓形虫包囊。 2、在ICR小鼠通过腹腔注射包囊方式可以稳定建立弓形虫慢性感染小鼠模型,一般选择10个包囊/只小鼠、腹腔注射的方式进行感染。 3、易感品系小鼠易感致死的原因可能系Th1与Th2免疫反应不平衡所致,过强的Th1型免疫应答可能是导致小鼠急性感染发生死亡的主要因素之一。 4、CD4~+ CD25~+调节性T细胞参与了弓形虫感染后小鼠的免疫抑制和免疫平衡。……   
[关键词]:弓形虫;易感性;CD4~+ CD25~+调节性T细胞;免疫抑制;免疫平衡
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2009年