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牛颗粒细胞和Hela细胞转染pXAISI-EGFP后的凋亡与增殖变化及其调节机制研究

甄艳红

   本研究应用基因克隆、质粒提取、细胞培养、脂质体转染、逆转录RT-PCR、实时荧光定量PCR、共聚焦显微定位、流式细胞仪分类、四甲基偶氮哇蓝(MTT)、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)等技术,旨在:①检测所构建的抑制素质粒的质量,分析其作用机制,为制备抑制素DNA疫苗奠定基础;②探讨抑制素过表达对卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的作用及其机制,为进一步阐明卵泡发育调节机制,开发促进卵泡发育的繁殖新技术奠定基础;③分析抑制素过表达对宫颈癌细胞(Hela细胞)凋亡和增殖的作用及其机制,探讨抑制素对子宫的作用,为开发提高胚胎发育率以及抗宫颈癌疾病的新技术奠定理论基础。研究内容和结果如下: 1.利用无抗性真核表达载体pVAX-asd和抑制素真核表达质粒pEGISI,成功构建无抗性的抑制素真核表达质粒pVAX-asd-ISI-EGFP(以下简称pXAISI-EGFP)。该质粒含有双拷贝的抑制素a(1-32)亚基片段、乙肝表面抗原基因HBsAg-S和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP 2.取原代牛颗粒细胞和传代Hela细胞,应用脂质体转染pXAISI-EGFP质粒,采用逆转录RT-PCR法在转录水平检测到抑制素 3.牛颗粒细胞和Hela细胞转染pXAISI-EGFP后,应用共聚焦显微镜进行亚细胞定位,发现抑制素融合蛋白在Hela细胞的细胞核中有表达,而在牛颗粒细胞中则表达于细胞质 4.应用V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测转染后Hela细胞的凋亡情况,发现转染48h后,空白对照组、pXAISI-EGFP实验组、pVAX-asd-EGFP阴性对照组的凋亡率分别为8.20±3.92%、24.86±5.38%、31.83±8.37%,差异显著(p<0.05),表明转染可以促进Hela细胞细胞凋亡,与阴性对照相比抑制素可以抑制Hela细胞凋亡。转染牛颗粒细胞后48h,显微观察证明抑制素可以促进牛颗粒细胞凋亡 5.转染后48h,采用MTT方法检测转染后细胞的增殖情况,牛颗粒细胞实验组与空白对照组和阴性对照组相比抑制率分别为41.86±1.24%和26.31±0.78%;Hela细胞实验组与空白对照组和阴性对照组相比抑制率分别为74.35±1.51%和38.64±3.60%;结果表明牛颗粒细胞和Hela细胞的增殖均受到抑制 6.利用流式细胞仪分析转染后48h碘化吡啶处理的细胞,检测细胞的周期变化情况。结果显示:GCs细胞空白对照组G0/G1期、S期和G2/M期比例分别为64.92%±1.75、15.53%±1.98和19.55%±1.32;试验组pXAISI-EGFP分别为55.07%±1.55、25.50%±1.48和19.44%±1.71; pVAX-asd-EGFP组分别为62.71%4±1.21、4.37%±1.37和32.91%±1.28。Hela细胞空白照组G0/G1期、S期和G2/M期比例分别为56.27±2.57%、30.24±1.36%和13.49±3.94%;试验组pXAISI-EGFP分别为55.75±2.70%、39.41±2.71%和4.84±0.04%; pVAX-asd-EGFP组分别为56.11±2.69%、36.20±1.48%和7.67±1.25%。发现无论是在牛颗粒细胞还是在Hela细胞中,抑制素均可使S期细胞增多 7.通过实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、NFKB、p53)及抑制素受体基因(TGFβR3)的表达量,发现在Hela细胞中抑制凋亡基因Bcl-2和NFκB表达量显著下调,相对表达量分别为0.62±0.02和0.38±0.01,促凋亡基因Bax和p53表达量上调,分别为3.24±0.12和2.58±0.06;在牛颗粒细胞中无论是抑制凋亡基因(Bcl-2、Bcl-xl)还是促凋亡基因(Bax、p53)的相对表达量都是上调的,分别为1.514±0.11、1.92±0.15、1.59±0.09、1.23±0.12。抑制素受体基因TGFβR3的表达量显著上调,牛颗粒细胞和Hela细胞中的相对表达量分别为16.15±0.14(p<0.01)和1.23±0.04(p<0.05),结果说明抑制素a(1-32)在颗粒细胞和Hela细胞中的超表达可显著提高其受体基因(TGFβR3)的表达 8.转染后24h、48h、72h、96h采用RIA法和酶联免疫法检测牛颗粒细胞培养液中相关激素(雌二醇、孕酮、雌二醇/孕酮、抑制素)水平的变化。结果显示雌二醇及雌二醇/孕酮在转染后24h升高,之后呈降低趋势;转染后孕酮分泌水平呈降低趋势,且转染后48h分泌量最大;抑制素激素水平与空白对照组及阴性对照组相比始终处于升高状态,但是转染72h时最低 这些研究结果表明,抑制素对牛颗粒细胞和Hela细胞的细胞增殖、周期、凋亡及凋亡相关基因、抑制素受体和相关激素分泌水平有显著的调节作用。……   
[关键词]:抑制素α;牛颗粒细胞/Hela细胞;细胞凋亡/周期
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年