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猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离

张坤

   在寒冷季节,猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PGAR)是引起猪腹泻的主要病原,其临床症状、病理变化和流行病学极为相似,在临床和组织病理学上很难区分。本试验建立了能同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PGAR)的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank登录的PEDV M基因、TGEV N基因、PGAR VP7基因,利用软件Primer 5.0设计合成三对特异性引物。经条件优化,我们建立了一种能够同时检测PEDV, TGEV和PGAR的多重RT-PCR的方法,并将这种方法和常规的RT-PCR进行了比较。特异性试验中,多重RT-PCR检测方法能够检测到35 pg的TGEV-PEDV-PGAR三联苗的混合RNA。在临床检测中,应用该方法检测了华中地区75份腹泻猪粪样,同时利用常规RT-PCR检测方法对该检测方法的敏感性和特异性进行了分析(PEDV、TGEV、PGAR敏感性分别为92%、100%、100%,特异性均为100%)。该方法敏感性高、特异性强,可用于腹泻样品中PEDV、TGEV和PGAR的检测。 利用已建立的PEDV、TGEV、PGAR多重RT-PCR检测方法对2009年1月至2010年2月来自湖北、河南、湖南、江西、广西等地区部分养殖场的197份猪腹泻粪样进行了检测。结果为PEDV感染58份,占29.44%;TGEV感染1份,占0.51%;PGAR感染15份,占7.61%。哺乳仔猪、保育及育肥猪和母猪三个生长阶段进行了统计分析:在PEDV 58份阳性样品中哺乳仔猪占24.14%、保育及育肥猪占55.17%、母猪占20.69%; TGEV仅从哺乳仔猪检出、保育及育肥猪和母猪未检测出;PGAR 15份阳性样品中哺乳仔猪占13.33%、保育及育肥猪占6.67%、母猪占80.00%。检测结果显示:在寒冷季节,在本次收集的腹泻样品中猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起不同生长阶段猪病毒性腹泻最常见的病原,其次是猪A群轮状病毒。 将三份轮状病毒阳性的腹泻猪粪样接种MA104细胞进行了轮状病毒分离,盲传至第三代开始出现明显细胞病变(CPE),将分离毒株依次命名为:TM-a毒株、WH-a毒株和GX-a毒株。对分离病毒进行了常规RT-PCR鉴定;同时依据GenBank发表的猪A群轮状病毒的VP6和VP7基因序列各设计了一对引物,对三株分离毒株的VP6和VP7基因序列进行了克隆及序列分析。结果显示TM-a株VP6基因与中国武汉人源A群R479毒株亲缘关系更为接近(94.4%),而与其VP7基因序列亲缘性最近的是印度人源A群RMC321毒株(95.1%);WH-a株VP6基因与中国北京人源A群LL3354毒株亲缘关系更为接近(96.0%),而与其VP7基因亲缘性最近的的是印度人源A群RMC321毒株(94.6%);GX-a株VP6基因与泰国猪源A群CMP74/01毒株的亲缘性最近(94.4%)。这些进一步证实分离的三株病毒为A群猪轮状病毒以及轮状病毒的多样性和复杂性。……   
[关键词]:病毒性腹泻多重RT-PCR;PEDV;TGEV;PGAR;病毒分离;VP6和VP7基因;克隆及序列分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年