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RNA干扰抑制草鱼呼肠孤病毒复制的细胞模型

李兵

  草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖对象。草鱼出血病是草鱼最为严重的疾病之一,死亡率高达90%,造成重大的经济损失。目前对该病尚缺乏有效的防治方法。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指小的RNA干扰分子(Small interfering RNA, siRNA)特异性地抑制同源基因的表达,它是广泛存在于生物中的一种基因沉默现象。由于RNAi具有高度特异性和高效性,可以作为抑制特定基因表达的工具。 本研究利用RNAi技术,在草鱼肾脏细胞系(Ctenopharyngodon idellus Kidney, CIK)上建立抑制草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)复制的模型,以期为定向抗病毒草鱼分子育种技术研究奠定前期基础。本论文主要进行了以下几个方面的研究: 1.在CIK细胞上大量增殖GCRV病毒,提取病毒的核酸,反转录得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR,扩增产物连接到T载体,转化大肠杆菌感受态细胞,提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆测序,得到GCRV的部分基因片段序列。 2.采用化学合成法分别合成靶向草鱼呼肠孤病毒RNA分段基因组L2片段上的RNA聚合酶基因(RdRp)和S10片段上的外衣壳蛋白基因(OCP)的小干涉RNA分子siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117。用Lipofectamine 2000转染CIK细胞。转染6h后用GCRV感染细胞,48h后收集感染细胞的培养液,测定病毒TCID50/0.1mL值。Trizol试剂盒提取感染细胞的总RNA,以细胞管家基因β-actin mRNA水平为参照,采用RT-PCR检测呼肠孤病毒siRNAs靶基因的mRNA水平。病毒滴度测定结果表明:转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后细胞培养液的病毒滴度分别为104.41±0.16、103.83±0.44和101.94±0.42,极显著低于病毒感染阳性对照组的病毒滴度(107.92±0.52,p<0.01),转染siRNA阴性对照组的病毒滴度为107.50±0.17,与病毒感染阳性对照相比,差异不显著(p>0.05)。RT-PCR检测结果显示:与病毒感染阳性对照相比,转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后的CIK细胞中GCRV mRNA水平显著下降(p<0.01),抑制率分别为82.08±2.15%、89.19±1.14%、92.96±0.17%,而转染siRNA阴性对照对GVRV mRNA的水平没有显著的影响(p>0.05)。结论:针对RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因设计并化学合成的siRNA特异、高效地抑制了草鱼呼肠孤病毒的复制。 3.针对GCRV RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因的3个位点,设计并合成了长度为63bp、5’端磷酸化用于质粒表达的3段含siRNA特异序列的寡聚脱氧核糖核苷酸正链和负链,经退火,克隆入pSilencer 2.1-U6 neo载体U6启动子下游,构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRP1441及pSi-OCP117,将表达质粒进行PCR鉴定并克隆测序。结果表明成功的构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRp1441、pSi-OCP117。……   
[关键词]:草鱼;草鱼出血病;草鱼呼肠孤病毒;复制;RNA干扰;抑制;病毒滴度;组织培养半数感染剂量;mRNA水平
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2009年