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黑大豆种皮花色苷物质组成及其抗氧化活性与抗血管平滑肌细胞增生作用

张芳轩

   随着基础医学研究的不断深入,人们逐渐认识到氧化应激是促进动脉粥样硬化等慢性疾病的发生发展的重要因素。探寻和研究具有抗氧化活性的天然植物化合物用于这些疾病的防治,成为医药、植物化学等多个学术领域共同关注的课题。黑大豆是我国传统的药食兼用的作物资源,其种皮含有大量多酚类化合物,是开发天然抗氧化剂的重要来源。本文通过比较60个黑大豆种质抗氧化活性和总酚、原花青素和花色苷含量差异,筛选出抗氧化活性最强、酚类物质含量最高的种质,并对其抗氧化活性与酚类物质进行相关性分析,从中确定黑大豆种皮中对抗氧化活性起主要作用的物质,再通过HPLC对主要活性物质进行定性定量分析,最后在细胞水平评价其抗氧化活性,并从抑制ox-LDL诱导VAMC增殖的角度探讨黑大豆种皮抗动脉粥样硬化的机理。主要研究结果如下: (1)分析了60个黑大豆种皮的总抗氧化能力(TAC)、氧自由基清除能力(ORAC)、DPPH清除能力及其与总酚、原花青素和花色苷含量的差异和相关性。结果表明60份黑大豆种皮的TAC、ORAC、DPPH、总酚、原花青素和花色苷含量变幅和变异系数较大,表现出显著的基因型差异。云南地区的黑豆17501和大黑秧是抗氧化能力和酚类物质含量最高的黑大豆种质。相关性分析结果表明,原花青素和花色苷是黑大豆种质种皮抗氧化活性的主要物质基础。采用快速聚类法可以把60份黑大豆种质聚成4类,Ⅰ类为高脂肪黑大豆种质,Ⅱ类为高蛋白高花色苷黑大豆种质,Ⅲ类为高脂肪高活性黑大豆种质,Ⅳ类为低脂肪低蛋白低活性黑大豆种质。 (2)参照Baj等人文献报道的色谱条件并对其进行优化,建立了一种准确高效的黑大豆种皮花色苷检测方法,并用该方法对60个黑大豆种质种皮花色苷的组成及含量进行了测定。黑大豆花色苷HPLC分析优化的色谱条件为:色谱柱XBridge C185.0μm 4.6mm×250mm,预柱4.6mm×20mm,检测波长520nm,进样体积20μL,柱温25℃,流动相:A:10%甲酸的水溶液B:25%乙腈,25%甲醇,10%甲酸,40%水;梯度洗脱:0~8min,16%~20%B;8~11min,20%~38%B;11~20min,38%~46%B.结果从60个黑大豆种质种皮中检测到飞燕草素-3-葡萄糖苷(Dp-3-glu),矢车菊素-3-芸香糖苷(Cy-3-gal),矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-glu),牵牛花素-3-葡萄糖苷(Pt-3-glu),芍药定-3-葡萄糖苷(Pn-3-glu),锦葵素-3-葡萄糖苷(Mv-3-glu)共6种花色苷。其中有44个品种中检测到上述全部6种花色苷,而其余16个品种只含有其中的4-5种。其中Cy-3-glu在各品种中均为含量最高的花色苷组分,含量变幅为61.82-1617.44mg/100g,占总含量的48.81%-94.13%,大黑秧是总花色苷和Cy-3-glu含量最高的黑大豆种质(2129.6mg/100g和1617.6mg/100g)。 (3)通过化学实验和细胞实验对花色苷单体的抗氧化活性进行追踪研究,并考察了其对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用。结果表明Dp-3-glu、Cy-3-glu、Pt-3-glu、Mv-3-glu和Pn-3-glu5种花色苷单体清除DPPH·自由基能力表现为:Dp-3-glu>Cy-3-glu>Pt-3-glu>Mv-3-glu>Pn-3-glu。与天然抗氧化剂Vc比较,Dp-3-glu和Cy-3-glu清除DPPH·毙力远大于Vc。Vc清除DPPH·的EC50值为7.62μg/mL,分别是Dp-3-glu, Cy-3-glu清除DPPH·EC50值的3.13、2.06倍。这5种花色苷单体均可不同程度的拮抗ox-LDL诱导VSMC增殖,Cy-3-glu抑制效果最高,且呈显著量效关系(P<0.05)。Cy-3-glu可明显提高细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力,抑制生物体的脂质过氧化反应,减少终产物丙二醛(MDA)的生成,同时还可抑制一氧化氮(NO)产生,且呈显著的量效关系(P<0.05)。Cy-3-glu和Pn-3-glu可以抑制细胞由G0/G1期进入DNA合成的S期而抑制VSMC增殖,Cy-3-glu作用效果更明显。……   
[关键词]:黑大豆;花色苷;抗氧化活性;血管平滑肌细胞;氧化低密度脂蛋白;动脉粥样硬化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年