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葡萄卷叶伴随病毒2分子变异及基因重组分析

徐铭霞

   葡萄卷叶病(Grapevine leaf roll disease,GLD)是世界上分布最广的葡萄病毒病,凡是葡萄栽培地区均有发生卷叶病。卷叶病的发生严重影响葡萄的品质和产量,造成重大经济损失。到目前为止,相继报道了11种可引起GLD的病毒,称为葡萄卷叶伴随病毒GLRaVs(Grapevine leafroll associated virus),即GLRaV-1-9,除此之外,Maliogka又报道了两种不同于以上九种的分离物GLRaV-Pr, GLRaV-De。这11种病毒均属于长线性病毒科(Closteroviridae),其中只有GLRaV-2为长线病毒属(Closterovirus)成员,除GLRaV-7尚未归属外,其它GLRaVs均归为葡萄病毒属(Ampelovirus)。 本研究采用RT-PCR技术对采自郑州国家葡萄种质资源圃、湖北省果茶研究所及华中农业大学葡萄园的表现卷叶病症状的70多份葡萄样品进行了RT-PCR检测,共检出11种样品带有葡萄卷叶病毒-2,并将所有检出样品扦插保存于温室,具体研究结果如下:1.从葡萄韧皮部组织中提取病毒双链RNA后,根据Marais在GenBank上登录的序列设计引物HSP-L1/HSP-R2,扩增获得GLRaV-2的HSP70部分基因片段(432 bp),CP-L1/CP-R2引物扩增获得其CP基因全长(597 bp),并对其进行克隆,每个样品选取3个克隆进行测序。序列分析结果显示,来自每个样品内的3个克隆片段间序列高度相似,其分离物内HSP70h遗传距离为0.000-0.008,CP遗传距离为0.002-0.010,因此来自11个样品的GLRaV-2可分别视为单个分离物,无复合侵染情况。2.11个GLRaV-2分离物的CP及HSP70基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列经DNAMAN比对,结果表明来自这些葡萄样品的该病毒CP基因比较保守,其核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别为97.3%-100%和98.5%-100%。但HSP70存在较大的变异,分离物间的HSP70核苷酸和氨基酸同源性分别为74.5%-100%和80.6%-100%,其中来自tr及hn的两个样品的GLRaV-2与其它9个分离物间存在极其明显的分子差异,这两个分离物间的HSP70核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和99.5%,而与其它各分离物间的核苷酸和氨基酸同源性分别仅为74.5%-75.8%和79.9%-82.6%。 3.将获得的序列与Genbank已登录序列进行比较分析,最终的系统进化树表明,对于CP基因分析,11种分离物与前期中国报道的两个分离物均相聚在以GLRaV-2-PN为代表的一个分支中。而对于HSP70所构建的系统进化树结果显示,11种分离物被分在GLRaV-2-PN及GLRaV-2-RG两个组中,tr及hn两个样品属于GLRaV-2-RG一组。 4.根据HSP70构建的系统进化树特点,选取各分支的来自藤稔、紫地球和大阪的代表性分离物,采用引物GLRaV-2-4/GLRaV-2-5对其ORF8与3 -NCR间的片段扩增,均获得预期大小约383 bp的产物。经克隆和测序,结果显示藤稔分离物与GLRaV-2-RG相应序列同源性为99%,而与紫地球、大阪序列同源性仅为76.5%-76.8%。 5.用基因重组分析软件RDP3对所得的三段序列进行分析,结果显示tr、hn两个样品中发生了基因重组,重组亲本来源于GLRaV-2-PN及GLRaV-2-RG。……   
[关键词]:葡萄卷叶病毒-2;热激蛋白70;外壳蛋白;克隆;分子变异;系统进化树;基因重组
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年