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利用酵母双杂交技术研究流感病毒NS2蛋白与宿主蛋白的相互作用

郑毅

   流感病毒的NS2蛋白具有核定位信号,可分布在宿主细胞核内,符合常规酵母双杂交技术对诱饵的要求。NS2在各种亚型的A型病毒中都比较保守,能介导病毒核蛋白复合体 (vRNP)的核输出过程。相对流感病毒的其它蛋白质来说,NS2的研究显得比较薄弱。本研究以期发现一些与NS2相互作用的宿主因子,拓展现有的流感病毒与宿主相互作用网络,为阐述流感病毒的的致病机制,提出新的疾病防控思路提供帮助。 酵母双杂交技术作为一种高通量手段,已应用于流感病毒蛋白与宿主蛋白质的相互作用研究。本论文以该方法为平台,以NS2为诱饵,从人胎脑cDNA文库中筛选与其互作的蛋白,研究互作可能的生物学功能。主要研究内容如下: 1)用禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)NS2蛋白为诱饵,从人的胎脑cDNA文库中寻找与之相互作用的蛋白质 将NS2克隆在诱饵pGBKT7载体上,转化AH109酵母,在确定NS2没有自激活现象后,利用AH109和Y187酵母可接合生殖的特性,将pGBKT7-NS2(+)AH109与含人胎脑cDNA文库的Y187酵母混合培养,经过三轮筛选最终得到10个候选阳性克隆。 2)GST pull-down对相互作用进行体外验证将NS2克隆到pGEX-6P-1载体上,原核表达得到GST-NS2并进行纯化。将10个猎物基因克隆到pET-32a载体上,得到HIS-Preys。在表达过程中发现,NS2能可溶性表达,10个猎物只有6个有明显的可溶性表达,它们分别是:stathmin样蛋白2(STMN2),DDB1 and CUL4相连因子6(DCAF6),含铜离子代谢所需结构域的蛋白(COMMD1),驱动蛋白家族的成员C2(KIFC2),真核转录延伸因子1的α亚基1(EEF1A),微管关联蛋白1B(MAP1B)。用这6个可溶性表达的蛋白进行GST pull-down实验,结果表明stathmin样蛋白2(STMN2)与NS2有相互作用,提示流感病毒感染对宿主细胞形态的影响可能与NS2有关。……   
[关键词]:禽流感病毒;H5N1亚型;酵母双杂交;GST Pun-down;互作
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年