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红色红曲菌交替氧化酶基因Mraox1克隆与功能初步研究

李琦

   在高等植物,大部分真菌和一些原生动物中存在2条电子呼吸链:细胞色素途径和交替途径。交替途径对氰化物不敏感,因此该途径又被称为抗氰途径,交替氧化酶是交替途径的末端氧化酶。交替途径与细胞色素途径在泛醌处分支,由交替氧化酶催化,泛醌将电子直接传递给氧化生成水,释放热量,不产生ATP。 本研究从红色红曲菌(Monascus ruber) M-7中克隆得到了交替氧化酶基因(alternative oxidase from Monascus ruber, Mraoxl),及其上下游部分序列,构建了Mraoxl的敲除载体。通过农杆菌介导,将敲除载体转入红曲菌M-7,筛选得到一株△Mraoxl突变子,并对这一株突变子进行了抗逆性分析和表达调控的初步分析。具体结果如下: 1. Mraoxl基因的克隆及序列分析 根据已报道的aox基因的核酸序列和其编码的氨基酸序列,设计了简并引物,扩增得到了Mraoxl基因的一段DNA序列。在此基础上,采用SON-PCR获得了Mraoxl基因的编码区及其上游和下游部分序列共4223bp,包括开放读码框1198bp,5’非编码序列2329bp和3’非编码序列696bp。经软件分析和预测,Mraoxl基因的开放读码框包含3个外显子和2个内含子。预测编码序列上游含有一个CRE-like元件和两个锌指蛋白结合位点。Mraoxl基因共编码350个氨基酸。其氨基酸序列与其他丝状真菌的AOX序列有很高的相似性,含有与双铁中心形成有关的EXXH和EEE-Y保守域。软件预测Mraoxl基因的编码氨基酸序列的N端的59个氨基酸为线粒体转运肽。 2. Mraoxl基因的敲除 以潮霉素抗性基因(hph)为筛选标记,构建Mraoxl基因的敲除载体,采用农杆菌介导转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT),对红曲菌M-7进行了两次转化,获得205株转化子。通过对140株转化子进行经PCR筛选和southern杂交验证,分离得到一株ΔMraoxl突变子。 3.Mraoxl功能的初步分析 3.1 H2O2、高温、pH值和渗透压对ΔMraoxl和M-7的孢子萌发率的影响 为分析Mraoxl是否参与环境应激过程,将105个/mL的ΔMraoxl和M-7的孢子液进行H2O2、高温、不同pH值和渗透压的处理,分析它们孢子萌发率的变化。 10、20和30mmol/L的H202水溶液处理5h后,ΔMraoxl的孢子萌发率较M-7分别低49%、42%和25%。40℃和50℃水浴处理1、2和3h后,ΔMraoxl的孢子萌发率均低于M-7,其中40℃处理2h时,差异值达到最大,为18%。经pH8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液处理2、4和6h后,ΔMraoxl突变子的孢子萌发率较M-7低,其中处理4h时,差异最大,为29%。经0.2、0.5和0.8mol/L的NaCl溶液处理之后24h后,ΔMraoxl与M-7的孢子萌发率无显著差异。综合以上实验结果,推测Mraoxl基因能够增强红曲菌的抗逆性。 3.2 cAMP和柠檬酸对ΔMraoxl与M-7生长的影响 在培养基中分别添加8mmol/L柠檬酸和2mmol/L的cAMP能够显著促进M-7在生长初期的生长,而对ΔMraoxl突变子则没有该现象,由此推测cAMP和柠檬酸能够提高Mraoxl的表达。……   
[关键词]:红色红曲菌;交替氧化酶;克隆;基因敲除;功能
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年
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