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mRNA差异显示法对长江华溪蟹镉中毒相关基因片段的筛查

袁慧;高爱保;王兰

  镉是一种容易在水溶液中迁移的重要的工业和环境化学污染物,对生物组织器官有着广泛的毒性损伤作用,因此研究镉的毒性及其致毒机制具有重要的理论价值和实际意义。长江华溪蟹(Sinopotamon yangtsekiens)终生栖息在淡水中,对污染物敏感性很高,是理想的环境监测指示物。mRNA差异显示技术具有高效、简便等优点,可广泛应用于鉴定新基因的研究,并可同时分析样品间基因表达差异。鉴于此,本试验采用mRNA差异显示技术,筛选并鉴定镉诱导鳃组织中差异显示的表达序列,寻找镉应答基因。以5mg/L的氯化镉染毒,于24h时提取鳃中的总RNA。反转录合成cDNA第一条链后,以3种锚定引物和24个随机引物组成引物对,进行PCR扩增。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测,获得清晰的差异条带后,回收差异条带并以相同条件进行二次扩增。结果表明,镉诱导前后,鳃组织中的基因表达存在差异,经初步分离获得一些差异基因。差异有两种,一种是基因表达量上的差异,镉染毒后基因表达高于或低于未染毒的基因表达;另一种是基因片段的新增和缺失。镉染毒后表达量增高的引物有:Oligo-dT、S7,片段大小约为400bp;表达量降低的随机引物有:S7、S34,片段大小约为745bp;扩增出新条带的随机引物有:S35、S11、S66,片段大小约为650bp、780bp、450bp;缺失基因片段的随机引物有:S449、S7、S23、S4、S56,片段大小约为550 bp、745bp。镉可以导致机体氧化损伤,抑制抗氧化酶的活性,诱导细胞凋亡,还可影响细胞死亡和增殖有关的基因及蛋白表达。本试验中镉染毒后,表达量增高的基因可能是镉诱导产生的应答基因;表达量降低可能是基因转录、翻译受到了镉的抑制;新增的表达基因可能是镉诱导的基因突变产生的;缺失的基因可能是由于镉造成遗传物质的损伤,如引起DNA链断裂,抑制DNA修复,导致DNA片段的缺失等。本研究已初步筛选获得了一些重复性较好的差异条带,并回收了部分片段。该结果经克隆和生物信息学分析后,可进一步从分子水平上研究镉对甲壳动物的致毒机理,为水产品的健康养殖与环境检测提供科学依据。……