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睡眠肽固相合成技术的研究

李吉平;徐静;孙玉成;刘琳娜;万家余;刘文森;高宏伟

  睡眠肽是Monnier等人于1977年从被剥夺睡眠的兔脑脊液中分离纯化的一种具有促睡眠活性的九肽类化合物,其氨基酸序列为Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu。其主要生理作用是促进动物的慢波睡眠,并能特异性的增强兔脑电图中的δ波,故名为Delta-睡眠肽。试验证明睡眠肽在促使动物快速进入睡眠状态后,醒来没有任何不适行为和反应。因此受到了脑力工作者和因各种疾病而影响睡眠人群的欢迎;此外它还可能被滥用作为躯体或精神失能性战剂应用于军事上,对人们构成潜在的威胁,被列为具有军事意义的生物调节剂。为此我们对睡眠肽的固相合成技术进行了研究。[目的]本试验旨在为大量获得睡眠肽找到一种快速的制备方法。[方法]①睡眠肽合成难易程度的分析用Write from Scratch软件对睡眠肽的氨基酸序列进行分析,分析每个氨基酸合成的难易程度,从而为编制每个氨基酸合成程序提供依据。②睡眠肽的固相合成技术在Syphony多肽合成仪中输入睡眠肽的氨基酸序列,并对每个氨基酸编辑合成程序,仪器按照设定的程序开始合成,一直到合成结束。③产物的切割及提取当睡眠肽合成结束以后,以三氟乙酸(TFA)为主要切割试剂,将合成的产物从树脂上切割下来;将切割下来的产物冰浴30min,然后在产物中加入2倍体积的冰乙醚,混匀后在2000r/min离心1.5min,弃掉上清,再用冰乙醚5mL重复处理沉淀3~5次。最后挥干乙醚,剩下的粉未为合成产物。④HPLC对合成产物的初步分析用LC-10A型高效液相色谱仪进行分析。分析条件:色谱柱为C18(250mm,5mm)柱,以5%乙腈0.1%TFA的水溶液为流动相A、以100%乙腈0.1%TFA的溶液为流动相B,在30min内流动相B由0%升到100%进行梯度洗脱,波长为217nm,流速为1mL/min,柱温25℃,进样量10μL。⑤产物的纯化在HPLC分析的基础上利用AKTAexplorer100蛋白质纯化系统对合成产物进行纯化。纯化条件:以C18(250mm,20mm)为色谱柱,以5%乙腈0.1%TFA的水溶液为流动相A、以100%乙腈0.1%TFA的溶液为流动相B,在30min内流动相B由0%升到100%进行梯度洗脱,217nm为检测波长,流速为5mL/min,柱温25℃,进样量2mL。⑥质谱鉴定将纯化的产物用AutoflexⅢMALDI-TOF质谱仪进行鉴定,并与标准睡眠肽质谱图进行比对。[结果]合成产物经质谱鉴定,分子量为849.15,其质谱图与标准睡眠肽质谱图一致。[结论]该试验为获得大量睡眠肽提供了一种技术手段。……