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微小隐孢子虫子孢子与宿主黏附相关蛋白质的筛选

郭安;尹继刚;向梅;刘贤英;张岩;陈启军

  目的筛选微小隐孢子虫与宿主细胞黏附相关蛋白质,揭示隐孢子虫在宿主体内寄生与致病机理。方法参照文献提取微小隐孢子虫总RNA并分离mRNA,利用反转录酶合成cDNA,将EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端连到双链cDNA的两端,定向插入到T7 Select 10-3b载体,构建微小隐孢子虫子孢子蛋白质噬菌体展示文库。利用Caco-2细胞对文库进行筛选。结果本试验构建的微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库初始文库的滴度为5.3×10~5pfu/mL,文库容量为1.5×10~5个重组子,92%的插入片段大于0.3kb.扩增后文库滴度为3.1×10~(10)pfu/mL。用Caco-2细胞筛选到6个微小隐孢子虫黏附相关蛋白质。结果显示:5个蛋白质含有N端信号肽,3个蛋白质含有跨膜区,表明这几个蛋白质或分泌到虫体之外,或嵌合在虫体表膜,是可能的黏附和侵入相关蛋白质。其中编码含有跨膜区蛋白质的基因XM_625389与顶器门其它寄生虫(如疟原虫、微小泰勒虫)的相关基因具有很高的同源性,表明该基因编码的蛋白质在顶器门寄生虫中功能保守,可能是潜在的黏附和侵入相关蛋白质。通过免疫荧光将该蛋白质在虫体上进行定位,发现该蛋白质定位于子孢子表膜。另外,XM_627245和XM_627859均编码粘蛋白类相关蛋白质,而且与已报道的GP900蛋白质在结构上相类似,具有粘蛋白样模体、半胱氨酸和苏氨酸富集模体,并具有O-糖基化位点。预测这两个蛋白质可能具有与GP900蛋白质相似的黏附功能。结论成功构建了微小隐孢子虫噬菌体展示文库,用Caco-2细胞对文库进行筛选,共筛选到6个微小隐孢子虫黏附相关蛋白质,其中1个为微小隐孢子虫重要的表面黏附蛋白质CP2,另外5个可能的黏附相关蛋白质的功能尚需进一步鉴定。……   
[关键词]:微小隐孢子虫;T7噬菌体展示;筛选;黏附
[文献类型]:会议论文
[文献出处]: 《第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集2008年