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SYBR Green实时荧光定量PCR构建AA鸡β-actin基因标准品和标准曲线及其应用

路伏增;蒋正宇;汪秀星;黄瑞华;刘红林

  目的:建立SYBR实时荧光定量PCR检测AA鸡β-actin基因mRNA表达的方法, 为了解AA鸡胰腺组织中功能基因的表达奠定基础。方法:以TRIzol裂解抽提法提取AA鸡胰腺组织总RNA,设计并合成鸡的β-actin基因引物,以RT-PCR法制备β-actin基因的目的片段并进行扩增和纯化回收,梯度稀释后作为标准品模板来进行实时荧光定量PCR扩增得到标准曲线,并在提取的AA鸡的胰腺组织中对β-actin基因进行了实时荧光定量扩增曲线分析。结果:实时荧光定量PCR条件优化后得到的标准曲线的斜率为-0.30,相关系数r2=1.000, Ct值在12.9和29.3之间,熔解曲线为特异的单个峰,其Tm为81.53±0.16℃;在提取的胰腺组织中对拾-actin基因进行实时荧光定量扩增曲线分析时发现Ct值较集中。结论:本实验建立的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法检测β-actin基因时具有很好的准确性和特异性,曲线的重复效果、稳定性很好,可在宽广的范围内进行定量检测,且操作简便、安全、快速;试验组AA鸡胰腺组织中β-actin基因的表达强度较一致,可以很好的作为内参基因来检测不同营养条件下胰腺组织中功能基因的表达水平。……