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花生HyPGIP原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定

王麒然;王琰;王志奎;张茹琴;迟玉成;夏淑春;鄢洪海

  依据已知多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP基因序列设计HyPGIP的扩增引物,以HyPGIP质粒为模板,扩增HyPGIP基因片段,通过10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。回收PCR扩增产物,与pGEM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。经PCR检测后送测序,提取质粒,利用BamH I和Sac I进行酶切,回收目的片段,同时酶切pET28质粒,利用T4-DNA连接酶连接目的片段和载体,转化BL21大肠杆菌感受态细胞,进行原核表达分析,通过上述方法成功构建了表达载体HyPGIP-pET28,转化BL21表达菌株,阳性菌株质粒PCR获得了951bp大小的去除信号肽的目的蛋白的基因序列。挑取单菌斑接种于含有相应抗生素的LB液体培养基中,于37℃振荡培养过夜。次日,将菌液按1:100转接到含相应抗生素液体培养基中,37℃震荡培养至OD_(600)为0.3,加入IPTG至终浓度0.3 mmol/L,诱导目标蛋白表达。继续于摇床培养3h。10 000r/min离心5min,收集已诱导的细胞,取上清液和沉淀物分别加入等体积的2×SDS上样缓冲液,充分悬浮菌体,沸水中煮沸变性5min,冰浴2min,SDS-PAGE电泳检测。结果发现含有重组质粒HyPGIP-pET28的BL21菌株,经过0.1mmol/L,IPTG,18℃,180r/min 12h诱导之后,在23ku、40ku中间处出现一条明显诱导带,与预期的37ku去除信号肽后的大小一致。将菌液按1:100的比例转接于培养基中,37℃摇菌至OD_(600)约为0.3 h,加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG,28℃200r/min培养3h,诱导目的蛋白表达。4℃,4 000r/min离心20min,去上清,沉淀重悬于20mL裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,pH8.0),然后进行超声破碎,4℃,10 000r/min离心20min,取上清加入1mL 50%的Ni-NTA树脂,4℃轻微振荡30min。将结合有目的蛋白的Ni-NTA树脂装柱。用不同浓度的咪唑漂洗液(20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L)漂洗3次。用250mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白。His标签蛋白纯化-亲和层析处理后,只有经IPTG诱导和沉淀中出现明显条带,说明目标蛋白以不可溶的方式的包涵体存在。……