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水稻纹枯病菌与水稻互作基因的筛选和表达分析

赵美;周而勋;舒灿伟

  水稻纹枯病(rice sheath blight)是水稻的重要病害之一,对水稻的生产造成严重的影响。据最新的病害预测,2016年我国水稻纹枯病菌发病面积达2.6亿亩,发病面积远高于稻瘟病。其病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是重要的土传真菌,除了为害水稻病害外,还可以侵染多达260种植物。由于缺乏可靠稳定的遗传转化系统,目前对该菌致病机理的研究还比较少。因此,本研究拟通过建立寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)技术体系研究水稻纹枯病菌关键致病基因的功能。首先利用水稻纹枯病菌基因组数据库RSIADB中的基因序列进行生物信息学分析,包括基因筛选、功能富集(GO和KOG)和表达趋势分析(short time-series expression miner,STEM),筛选出水稻纹枯病菌与水稻互作的候选基因;再利用水稻纹枯病菌强致病力菌株GD-118(其全基因组序列已经公布)活体接种水稻9311品种,分别在6个时间段(10h,18h,24h,32h,48h和72h)收集水稻叶片,利用荧光定量PCR技术验证、筛选基因的表达模式。最后选择在侵染初期高度上调表达的基因,构建HIGS表达载体,再通过根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)方法转化水稻,获得了转基因的水稻植株。根据RSIADB中的分泌蛋白、病原菌与寄主互作数据库(PHI)、碳水化合物活性酶数据库(CAZy)信息和转录组测序结果,利用Venn分析最后筛选出15个高FPKM值的候选基因,GO分析发现这些候选基因主要参与水解酶活性、碳氧裂解酶活性和转移酶活性等生物学功能,KOG分析发现这些基因与细胞壁生物合成、细胞骨架和碳水化合物转运和代谢有关,STEM分析把这15个基因归类为5个不同的表达趋势。荧光定量PCR结果发现5个候选基因(AG1IA_00256,AG1IA_09356,AG1IA_06529,AG1IA_06159和AG1LA_03930)的表达量在侵染早期(10h和18h)高度上调,与转录组测序的结果基本一致,因此将其选为HIGS体系的候选基因。根据这5个候选基因的序列,利用pBDL03构建沉默载体后通过ATMT方法转化水稻,获得了稳定的转基因后代植株。本研究通过生物信息学和荧光定量PCR分析,获得了5个在侵染水稻早期上调表达的基因,建立了HIGS技术体系,并获得了转基因水稻植株,为进一步阐明这些基因的致病过程和机理奠定基础。……