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组织蛋白酶B对文蛤幼虫生长变态的调控作用研究

王晓梅;刘保忠;相建海

  组织蛋白酶 B(CB)在生物体中分布广泛,具有多种生理功能。但 CB 在海洋动物研究很少,尤其是其在贝类幼虫发育过程中的作用未见报道。本实验根据已有的文蛤幼虫 EST 序列,克隆了 CB cDNA 全长。实验样品是以下四个幼虫期:担轮幼虫期(L1)、D 形幼虫期(L2)、壳顶幼虫期(L3)、稚贝期(L4)。实验利用半定量 PCR 和整体原位杂交技术对 CB mRNA 在幼虫不同发育时期的表达量和表达部位进行了研究,通过免疫组化方法研究了 CB 蛋白在幼虫中的分布。另外,实验研究了 CB 特异性抑制剂对文蛤幼虫生长和变态的影响。结果表明,克隆获得的 CB 酶原的 cDNA 全长,与其他物种有很强的同源性,具有蛋白酶活性部位的三个保守氨基酸残基(Cys-111,His-282和 Asn-302),含有16个氨基酸残基的信号肽,共有16个半胱氨酸残基。半定量 PCR 分析发现随着幼虫的发育,CB 表达量逐渐升高。整体原位杂交的结果表明,CB 的 mRNA 在 L1没有集中的分布部位,在 L2、L3、 L4幼虫胃部有明显的表达,在 L2的幼虫除了胃部,在腹部靠近壳边缘也有阳性信号。免疫组化的结果显示,CB 的蛋白在 L1的中部表达,在 L2、L3、L4的胃部表达,L2的壳边缘外套膜部位有表达,在 L2、L3面盘基部也有表达。幼虫饥饿实验表明,幼虫在0.02μm滤膜过滤海水中培养孵化后,加入10μM的组织蛋白酶特异性抑制剂的实验组。与对照组相比生长速度显著降低。在幼虫壳顶后期加入抑制剂,实验组变态率显著低于对照组。根据 CB mRNA 和蛋白在 L2的表达部位,以及饥饿实验的结果推断,CB 对贝类幼虫生长和发育过程中营养摄取和消化具有重要的调控作用。CB 在 L3面盘表达及变态实验的结果推断,CB 可能与变态幼虫面盘脱落有关。……