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黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子致病性

刘莉铭;古勤生

  黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)属于帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的成员。该病毒系种子传播,对葫芦科作物危害较大,在我国尤其是嫁接西瓜易发生该病毒病害,已列为我国检疫性病害,防治难度较大。为此,通过构建该病毒的侵染性克隆,采用定点突变技术对CGMMV各编码蛋白进行突变,分析突变体产生症状以及发病时间的影响,探明病毒基因组中致病的分子决定簇,将会加深人们对该病毒致病分子机理的认识,为防御该病毒病害提供新的思考和路径。主要研究结果如下:(1)构建了CGMMV、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)的侵染性克隆。由于病毒侵染性克隆构建技术仍是病毒学研究的一个重要瓶颈,本文除选用CGMMV为研究对象外,也采用了ZYMV和WMV作为材料,以便能够更好地探讨病毒侵染性克隆构建的技术。利用传统的酶切连接方法获得CGMMV的侵染性克隆pXT1-CGMMV,利用同源重组方法获得ZYMV和WMV的侵染性克隆pXT1-ZYMV和pXT1-WMV,通过接种寄主植株,并结合DAS-ELISA、RT-PCR和Northern Blot相关检测证实了各侵染性克隆均具有侵染性,三种侵染性克隆均成功构建;(2)明确了CGMMV不同蛋白编码区域对于致病性和症状的影响。利用定点突变技术对pXT1-CGMMV进行突变分析,共获得37个复制相关蛋白突变体、21个运动蛋白(Move Protein,MP)突变体和22个外壳蛋白(Coat Protein,CP)突变体,通过接种本生烟,发现复制相关蛋白和MP不同位点突变主要与病毒致病性有关,CP不同位点突变不但可以影响病毒的致病性,而且可以改变病毒在寄主上所引起的症状。利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)表达系统对CGMMV复制相关蛋白的解旋酶区域(RNA Helicase,HEL)、间隔区(Internal Region,IR)及MP和CP区域在病毒侵染过程中可能发挥的作用进行了检测,发现HEL和IR能降低PVX的致病性,说明这两个区域可能与CGMMV的致病性强弱有关;MP和CP可以改变PVX在本生烟上所引起的症状,说明MP和CP可能与CGMMV症状的产生有关。(3)发现了CGMMV复制相关蛋白的一个氨基酸位点Arg284产生回复突变,明确了Arg284回复对病毒致病性的影响以及回复突变产生的规律。通过接种实验发现了CGMMV复制相关蛋白Arg284的回复突变,且该位点回复与病毒致病性的恢复有关。通过对CGMMV进行aa284突变分析,发现病毒致病性、回复所涉及的碱基突变数量和类型与Arg284的回复有关。对CGMMV复制相关蛋白其它精氨酸位点进行半胱氨酸突变分析,未发现精氨酸的回复现象。利用瞬时表达和共侵染接种方法对回复现象产生的原因进行分析,发现沉默抑制活性并不是Arg284发生回复的决定性因素,Arg284回复机制仍需进一步研究和探讨。……