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甜瓜棒孢叶斑病病原菌鉴定、生物学特性研究及T-DNA插入体库的构建

李俊香;古勤生

  棒孢属(Corynespora cassiicola)真菌是无性型真菌丝孢菌纲暗色丝孢科中的重要类群,主要引起叶斑病,该类真菌种类繁多,寄主范围及地理分布广泛。农杆菌介导的遗传转化成为真菌实现菌种改良、新基因标记及目的基因的筛选、分离和克隆的重要方法之一。该方法操作简单、受体范围广、转化率高、单拷贝率高及突变体遗传稳定,解决了传统转化方法的瓶颈。截止目前,在国内外,有关甜瓜棒孢菌的相关报道相对较少,鉴于此,本研究以从广西武鸣采集的病样中分离得到的甜瓜棒孢叶斑病菌为受体材料,利用农杆菌介导的方法构建T-DAN插入突变体库,完成对转化子的分子鉴定。主要研究结果如下:2015年10月在我国广西武鸣的厚皮甜瓜叶片上发现一种新的叶斑病。该甜瓜叶斑病典型症状表现为仅危害叶片,病斑圆形或不规则形,棕色,有的有黄色晕圈,呈轮纹状。该病原菌疑似通常危害植物叶片引起叶斑病的多主棒孢菌。将病样带回,采用病原分离,致病性试验,形态学观察及多基因测序的方法对引起该病的病原菌进行了鉴定,同时对该病原菌的生物学特性和常见杀菌剂的敏感性进行了测定。在PDA平板上,病原菌菌落圆形,中间墨绿色,边缘浅褐色。分生孢子呈圆柱形或倒棍棒形,单生或串生,直立或稍微弯曲,具0-13个隔,大小为3.1–6.4×14–138.9μm。克隆测定该病原菌的4个基因序列ITS1,2、ITS4,5、ACT、TUB2。甜瓜叶片上分离纯化的病原菌回接到甜瓜幼苗及离体叶片上,甜瓜幼苗及叶片均表现出与田间相似的症状,并能从病叶上不断分离该病原菌,符合柯赫氏法则。接种该病原菌的西瓜和黄瓜幼苗及离体叶片均发病。病原菌菌丝生长的最适碳源是葡萄糖,最适氮源是KNO3,最适温度是27°C,最适p H是6–9。分生孢子萌发的最适碳源是蔗糖和葡萄糖,最适pH是5–8。在室内采用菌丝生长速率法测定了23种杀菌剂对多主棒孢的抑菌能力。对该病原菌抑制效果较好的杀菌剂是50%咪鲜胺锰盐WP、30%苯醚甲环唑SC,40%氟硅唑EC,80%福美双WG。建立农杆菌介导的甜瓜棒孢菌的高效遗传转化体系。本研究发现,抑制甜瓜棒孢菌生长的最佳潮霉素浓度为100μg·mL-1,抑制农杆菌生长的最佳特美汀浓度为200μg·mL~(-1)。本研究中以甜瓜棒孢菌的分生孢子作为转化受体,摸索建立了转化体系,转化效率较高,可以达到20~30个转化子每1×105个/mL的分生孢子。在此转化体系条件下,转化效率对转化子进行分子鉴定。对转化菌株运用特异性引物进行PCR扩增、测序,结果证明转化菌株含有T-DNA插入基因片段。目前获得转化子209个,用于致病性分析。……