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黄瓜绿斑驳花叶病毒的解旋酶区域与寄主因子的互作

刘珊珊;古勤生

  病毒的成功侵染及病害症状的形成与病毒和寄主因子之间的互作密切相关,近年来关于病毒与寄主因子的互作研究发现许多寄主因子通过与病毒蛋白互作参与病毒的侵染循环和症状的形成。黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),是重要的瓜类病毒之一,在世界范围内,对葫芦科作物的生产造成严重的经济损失。目前关于CGMMV与寄主因子的互作研究还很少,本研究中我们用CGMMV复制酶中的解旋酶(Helicase,HEL)作为诱饵蛋白,利用酵母双杂系统筛选与其互作的寄主因子。首先利用SMART技术构建了感CGMMV的西瓜茎间组织的cDNA文库,文库滴度:5.4×10~8 cfu/ml,文库插入片段平均长度1 Kbp,文库重组率100%,文库质量较高,符合文库筛选要求。以CGMMV HEL作为诱饵筛选西瓜cDNA文库,初步获得3个与HEL互作的寄主因子,分别为Peptide methionine sulfoxide reductase Msr A、Chlorophyll a-b binding protein 37和Class I heat shock protein Hsp20。热激蛋白是广泛存在于各类生物体中响应各种胁迫的分子伴侣蛋白,目前关于热激蛋白与病毒互作的报道主要涉及HSP70和HSP90,小分子热激蛋白(sHSP)与病毒互作的报道还比较少。在本试验中我们首先通过双分子荧光互补试验、GST pull-down和CO-IP技术对sHSP与HEL的互作进行了进一步的验证,证实了sHSP与HEL互作的真实性。我们克隆了烟草、黄瓜和葫芦的与西瓜sHSP同源性最高的sHSP,通过酵母双杂验证了烟草、黄瓜和葫芦的sHSP同样也可以与CGMMV HEL互作。sHSP的亚细胞定位发现,sHSP聚集成粒子状存在于细胞质中,酵母双杂交发现sHSP自身可以发生互作,所以sHSP可能主要通过自身互作形成低聚物存在于细胞质中。sHSP和HEL的共定位发现,HEL也结合于这些粒子上,所以HEL可能与sHSP的低聚物结合形成复合物影响病毒的侵染循环。通过qRT-PCR检测西瓜、烟草感CGMMV后sHSP的表达量差异发现,CGMMV侵染后,西瓜和烟草的sHSP均明显上调。以上结果说明,sHSP在CGMMV的侵染过程中发挥着重要作用,其对病毒侵染的具体作用需要进一步研究和探讨。本研究首次报道了与CGMMV HEL互作的寄主因子,并通过多种方法验证了HEL与sHSP互作的真实性,为解析CGMMV与寄主因子的互作奠定了基础。……