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甘薯乔治亚曲叶病毒外壳蛋白基因的原核表达及Sweepoviruses荧光定量PCR检测方法的建立

赵晓立;田雨婷;王永江;王爽;乔奇;秦艳红;张德胜;张振臣

  菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒属于双生病毒科(Geminiviridae)。系统发育分析发现,侵染甘薯的Begomoviruses与侵染其他植物的双生病毒明显不同。因此,把侵染甘薯的Begomoviruses病毒统称为 Sweepoviruses 。Sweepoviruses是甘薯上的一类重要病毒,引起甘薯产量降低和种性退化。我国甘薯上已报道的Sweepoviruses共有7种,其中,甘薯乔治亚曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Georgia virus,SPLCGV)是我国甘薯上的新记录种。目前对我国甘薯上Sweepoviruses病毒的研究刚刚起步,对其生物学特性、分子变异不清楚,也缺乏高效的检测方法,导致对病毒的防控存在盲目性,对病毒的监测预警缺乏技术手段。针对这些问题,本研究利用PCR方法克隆了11个SPLCGV中国分离物的外壳蛋白(CP)基因并进行了序列测定。序列分析结果表明,SPLCGV中国分离物CP基因全长均为765 bp,推测可编码254个氨基酸残基。SPLCGV中国分离物CP基因的核苷酸序列相似性为91.4%-100%,推测的氨基酸序列相似性为95.7%-100%,存在较大的分子变异。将SPLCGV(Sichuan7:2012)CP基因的部分片段克隆到原核表达载体p ET-28a(+)上,并在大肠杆菌中BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,产生了预期大小的蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。根据我国甘薯上已报道的7种Sweepoviruses病毒的核苷酸序列,设计了一对通用引物和一条探针。通过一系列条件的优化,建立了针对Sweepoviruses的荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法能够对Sweepoviruses进行特异性检测,标准曲线的斜率为-3.261,相关系数为0.999,扩增效率为102.603%。检测灵敏度比普通PCR高出两个数量级,可用于甘薯田间样品的检测,为Sweepoviruses病毒的早期预警和流行学研究提供了技术手段。……