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纤维素酶基因在酵母菌中的高效表达

卢敏;常娟;尹清强

  合理地开发与利用纤维素资源对于缓解能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。天然的微生物生产纤维素酶存在酶产量和活性低等问题,应用基因工程技术来获得高活力纤维素酶资源越来越受到人们的重视。本研究从康氏木霉的DNA中扩增得到外切葡聚糖酶CBH I基因,将其插入到毕赤酵母分泌型表达载体pGAPZαA中,将重组表达质粒pGAPZαA-CBH I线性化后通过高压电击手段转入到毕赤酵母(pichia pastoris)X-33中,对重组毕赤酵母发酵培养液进行SDS-PAGE蛋白电泳测定其酶活性,并对酶的生化特性进行分析。主要内容以下以下:采用PCR技术扩增得到CBH I基因,与克隆载体PMD19-T连接后转入大肠杆菌DH5α,测序及序列比对结果显示该DNA序列全长1 626bp,与Genbank已公布的Trichoderma viride(FJ87 1063.1)的同源性达到99.63%,推测其编码的蛋白质含497个氨基酸,分子量约为52.29kDa,蛋白质等电点pI=4.28。将CBH I基因与表达载体pGAPZαA连接后,通过过渡宿主大肠杆菌再转化到毕赤酵母X33中,将经过鉴定的重组酵母茵株接种于YPD液体培养基,定时取样进行纤维素酶活性检测与SDS-PAGE电泳分析。结果显示:重组酵母菌发酵培养液羧甲基纤维素酶活力最高达到1.179 8U/ml,微晶纤维素酶活力最高达到0.127 6U/ml,SDS-PAGE蛋白电泳显示表达蛋白的分子量约为53kDa,表明成功克隆了康氏木霉外切葡聚糖酶CBH I基因,并且该基因在毕赤酵母中成功表达。该重组酶最适反应温度为45~50℃,最适反应pH值为4.5~5.0。该研究为纤维素资源的开发和利用奠定了基础。……