手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

聚乙二醇定点修饰的人血清白蛋白的制备及其药代动力学研究

赵婷;谭海宁;程艳娜;刘金锋;庞广礼;王凤山

  目的人血白蛋白(human serum albumin,HSA)是一种含585个氨基酸残基的单链无糖基化蛋白质,是人血浆中最丰富的蛋白质,约占血浆总蛋白的60%,在人体内具有维持血容量和血液胶体渗透压等重要生理功能。HSA是临床上常用的一种天然血液制品,由健康人的血浆中分离提取制成,属于血容量扩充药物,主要用于治疗失血、烧伤及创伤等引起的休克,脑水肿、大脑损伤所致的颅内压升高,以及低蛋白血症及肝硬化或肾病引起的水肿和腹水。然而在烧伤、感染或手术等某些病理条件下,毛细血管通透性增加,导致HSA向血管外泄漏,且从血管渗出的HSA常在敏感组织聚集,从而加重或引起组织水肿。另外,HSA适应症广泛,且用量大(每个病人每天HSA用量达几克),拥有巨大的市场需求量。但是近年来,由于血液来源紧张等原因致使HSA供应十分紧张,如何解决当前白蛋白紧缺的问题成为目前白蛋白研究的热点。针对以上人血白蛋白来源短缺及在某些病理条件下大量输注血管保留率低,易引起或加重组织水肿的问题,本实验设计通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰的方法将分子量较大的PEG分子共价连接到白蛋白分子上,增大白蛋白的分子量,赋予白蛋白分子较大的水化体积,从而减少HSA分子透过血管内皮细胞间隙进入周围组织,提高HSA的血管保留率,减少其引起组织水肿的副反应。同时,PEG修饰也可以改善蛋白质药代动力学性质,延长白蛋白的体内半衰期,降低用药频率,缓解临床上白蛋白短缺的问题。方法本实验以白蛋白分子上唯一一个游离半胱氨酸(Cys~(34))为修饰位点,采用分子量为20000D的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(PEG-mal)对白蛋白进行定点修饰。采用单因素分析考察PEG与蛋白质的反应配比、温度、缓冲液pH值和反应时间对修饰产率和产物分布的影响,确定最佳反应条件。修饰反应产物经阴离子交换柱层析和超滤等技术进行分离纯化,从而获得均一的修饰产物(PEG-HSA)。对修饰产物的理化性质包括纯度、表观分子量、修饰位点和二级结构等进行了研究,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶渗透色谱(GPC)鉴定纯化产物的纯度,SDS-PAGE测定其表观分子量,采用封闭偶联两步法鉴定修饰位点,圆二色谱法测定其二级结构。采用放射性同位素(~(128)I)标记法研究修饰产物在小鼠体内的药代动力学性质,以脂多糖诱导的急性肺损伤为模型,测定了PEG-HSA在肺组织中的血管透过率。结果结果显示修饰反应在最佳反应条件下总修饰产率达50%以上,单修饰产物在所有修饰产物中占95%左右。SDS-PAGE结果提示修饰产物的表观分子量在95000D左右。采用本实验设计的分离纯化方法能获得均一的修饰产物,纯度达98%。PEG-HSA的CD光谱与HSA的极为相似,二者的二级结构基本相同,提示定点PEG修饰并未影响HSA的二级结构。小鼠体内的药代动力学研究结果显示经尾静脉注射给药后,PEG-HSA的血浆半衰期延长为原来的2.2倍,同时总体清除率和稳态分布体积有所降低。在急性肺损伤实验中测得每克肺组织中透过血管的白蛋白为0.057±0.017mmol,而PEG-HSA的透过量仅为0.034±0.007mmol,两者比较有显著性差异,提示PEG修饰能显著提高HSA分子的血管保留率。结论以上实验结果表明聚乙二醇修饰能改善人血清白蛋白的药代动力学性质,延长人血清白蛋白的体内半衰期。在血管透过率增加的炎症条件下能显著提高白蛋白的血管保留率,有助于白蛋白发挥其扩充血容量的药理作用。在血管通透性增加的病理条件下,聚乙二醇修饰的人血清白蛋白有望成为一种优良的血容量扩充药。……