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hG-CSF大肠杆菌分泌表达系统的构建

王富强;周兴军;王彦芳;田雪虹;张谦;贺秉坤

   大肠杆菌表达系统用于外源蛋白表达已经取得了令人瞩目的成果,是基因工程多肽药物生产的基础。建立自己的高效表达系统将极大地促进我们的研究及开发工作。如果外源基因在大肠杆菌中表达形成可溶性,正确折叠,具有生物活性的蛋白,并分泌到培养基中,将为下游的纯化工作带来极大便利,有效提高生产效率。为此,我们构建了hG-CSF大肠杆菌分泌表达载体pSEGF,成功地将hG-CSF蛋白分泌到培养基中。 以pHBGF质粒为模板,用PCR方法扩增出人G-CSF cDNA片段。PCR产物两端分别加入了EcoRI和BamHI酶切位点。PCR产物经双酶切后,与以同样酶切过的pEZZ18质粒连接,转化DH5α宿主菌,挑选阳性克隆。经DNA序列测定分析,证实编码正确,得到hG-CSF大肠杆菌融合分泌表达质粒,定名为pSEGF。将pSEGF/DH5α工程菌,在LB培养基中进行表达。过夜培养液离心,取上清液300μl,丙酮沉淀后SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色。以pEZZ18/DH5α培养液上清及DH5α培养液为对照。结果表明,在Mr34,000附近,pSEGF比对照多出一条带,和预期的融合蛋白的分子质量一致。培养上清液与菌体渗透液(Shockate)分别做Western……   
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