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DSB修复蛋白hKu70缺陷对砷化物所致遗传毒作用的影响

刘起展;庄志雄;江高峰;何云;杜柳涛

  目的:砷化物既是致癌物,也是肿瘤治疗药物,其机制均不清楚。hKu70蛋白是修复DNA双链断裂(DSB)重要组分之一。探讨hKu70蛋白缺陷对砷化物所致遗传毒作用的影响,从而阐述砷化物引起机体损伤的部分分子机制。方法:抽提正常人胚肺成纤维(HLF)细胞总RNA、RT-PCR扩增目的cDNA片段、T载体克隆、重组,将目的cDNA片段反向插入表达载体,构建hKu70基因反义RNA绿色荧光真核表达载体;转染HLF细胞,G418筛选和维特,Western blotting检测hKu70蛋白含量;分别以0.0、1.0、2.5、5.0和10.0μmol/L NaAsO_2对hKu70蛋白缺陷细胞(HLFK)和空载体转染细胞(HLFC)染毒2、8和24 h,检测微核与核异常形成、碱性单细胞凝胶电泳(SCGE)检测DNA损伤、中性SCGE检测DSB损伤、流式细胞仪检测细胞周期。结果:成功构建含hKu70基因467 bp cDNA目的片段反向插入的绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-K);HLFK细胞hKu70蛋白含量比HLFC细胞降低了62%;高浓度NaAsO_2引起正常细胞的微核率和核异常率明显高于对照组;碱性和中性SCGE的拖率率、尾长及DNA断裂分级明显高于对照组,并与剂量存在一定正相关性;同一剂量组HLFK细胞比HLFC细胞的DNA损伤及DSB损伤更严重;低浓度NaAsO_2引起正常细胞出现明显G_1期关卡阻滞,细胞增殖能力降低;而高浓度NaAsO_2则破坏了G_1期关卡阻滞,表现G_2期关卡阻滞;HLFK细胞的G_0-G_1期细胞百分比显著高于HLFC细胞,增殖指数显著低于HLFC细胞,提示HLFK细胞的G_1期关卡阻滞比HLFC细胞更严重。结论:砷化物可引起细胞明显的DNA损伤,特别是DSB损伤,而且DSB修复缺陷可明显加重其遗传毒作用,提示DSB是砷化物所致遗传毒作用的重要机制之一。……