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应用DNA分子标记分析我国部分地区常见嗜尸蝇类

郑学礼;胡佳林

  嗜尸昆虫种属鉴定是利用昆虫进行检案的重要一步,它对案件的侦破起到关键性的作用。本研究采集了中国部分城市即广州、深圳、阳江、南京、长春、宜昌、北京、武汉、成都等12个地区常见嗜尸蝇类:家蝇(Musca,domestica),丝光绿蝇(Lucilia,sericata),大头金蝇(Chrysomya,megacephala),黑尾麻蝇(Parasarcophaga,crassipalpis)等。应用微卫星ISSR、rDNA-ITS2基因分子标记,对12个地区的5种腐肉蝇类进行了鉴定。该研究设计了22个ISSR引物,从中筛选出8个引物用于我国不同地区法医蝇类鉴定,8个引物总共扩增样品次数121,可放大679个清晰和稳定的带,其中516个是多态性,平均放大带数为5.6条。8种ISSR引物鉴定我国部分城市与地区5种蝇类,结果显示我国不同城市与地区的家蝇、大头金蝇、丝光绿蝇、棕尾麻蝇、黑尾麻蝇,分别呈现不同带谱,不同地区的家蝇呈现种内与地域多态性的遗传带谱,而5种腐肉性蝇种间呈现完全不同的带谱。八种ISSR引物鉴定我国不同地区5种腐食蝇类,发现了种特异性的片段。一些种特异性ISSR片段被克隆、测序,转换为SCAR标志物。采用家蝇SCAR特异引物扩增8个不同地区的家蝇样本和对照蝇类:丝光绿蝇、大头金蝇、棕尾麻蝇、铜绿蝇,结果显示8个地区家蝇样本均扩增出特异性600bp片段,而对照蝇类:丝光绿蝇、大头金蝇、棕尾麻蝇、铜绿蝇均未扩增出特异性片段。八种ISSR引物PCR扩增鉴定我国不同地区常见蝇类的聚类分析,10个不同地区家蝇聚类为一棵分枝树,细分为4个不同层次的类群,揭示不同地区家蝇种类存在种内基因型的差异。不同地区大头金蝇、丝光绿蝇的绝大多数种类聚类在一起,亦存在种内基因型与地理株基因组DNA差异。依据Drosophila melanogaster的nrRNA序列,设计扩增不同地区家蝇rDNA-ITS2基因的引物,PCR扩增不同地区家蝇基因组,获特定基因片段,SSCP分析。将PCR扩增不同地区家蝇rDNA-ITS2片段克隆于pMD-18T载体,序列测定,采用Clustal W软件在线分析不同地区家蝇rDNA-ITS2序列,用MegAlign(4.0)软件的UPMGA方法构建系统发育树。结果显示:应用引物MDF1和MDR1扩增我国六个省7个地区8个家蝇样品的rDNA-ITS2基因,均获大约360bp阳性扩增区带。SSCP分析不同地区家蝇的rDNA-ITS2基因的结果显示:不同地区的8个家蝇样品的rDNA-ITS2的SSCP电泳DNA迁移率均有一定差异。Clustal W比对分析不同地区的8个家蝇rDNA-ITS2基因序列,结果表明不同地区的8个家蝇rDNA-ITS2基因序列之间存在一定差异。不同地区的8个家蝇rDNA-ITS2基因序列同源性为75%,而其中部分地区家蝇样品rDNA-ITS2序列同源性高,家蝇(长春)、家蝇(吉林)、家蝇(养殖),三者之间的同源性为98%~99.1%;家蝇(成都)、家蝇(南京)、家蝇(广州)、家蝇(湖北荆州)之间的同源性为99.1%~99.7%。系统聚类分析显示:发育树共分成两支,~支是家蝇(北京)与家蝇(养殖)关系密切,先聚为一类,然后与家蝇(长春)再聚类;另一支是家蝇(成都)与家蝇(荆州)关系密切,最先聚类,然后与家蝇(南京)聚类,再与家蝇(广州)聚类,最后与家蝇(吉林)聚类。结论 :(1)首次应用ISSR技术对我国12城市和地区的常见嗜尸蝇类做出鉴定,显示ISSR-PCR技术鉴定嗜尸蝇类,是一种简便可靠的分子标记。SCAR标志物鉴定可鉴定不同蝇种类。(2)应用PCR-SSCP和rDNA-ITS2基因序列分析我国部分地区家蝇种群,揭示我国不同地区家蝇基因组序列存在一定差异。尚未见文献报告。……