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黄瓜侧枝抑制基因的克隆和功能验证

原丽华;蔡润;朱立煌

  植物的侧生分生组织在形态建成中占有重要的地位,侧枝的发育进程及侧枝的数目很大程度上决定了植物的光合和生殖特性等重要农艺性状。侧枝发育的精确机制还知之甚少,但很多和侧枝发育相关的突变体已经在水稻和拟南芥等模式植物中分离得到,这些突变体可以分为两大类:一类是和侧芽生长相关的突变体,这类突变体由于顶端优势的解除而表现出分枝较野生型明显增多,另一类则是侧芽原基起始障碍造成的突变体,在番茄ls和拟南芥las突变体中,其植株叶腋缺失了腋生分生组织细胞,在营养生长期不能形成腋生分生组织,进而导致植株没有侧枝。在水稻mocl突变体中,由于腋芽分生组织的起始障碍导致了植株呈独秆表型。番茄ls,拟南芥las,以及水稻mocl是最早影响腋坐分生组织形成的基因之一,是植物特有的GRAS转录因子家族的重要成员。黄瓜的侧枝数目是产量构成的重要影响因子,其一直被当作受多基因控制的数量性状进行研究,尚未克隆出相应的基因,更未能对控制黄瓜分枝的分子机理进行探究。本实验室收集了三种分枝类型的黄瓜材料:多侧枝(几乎每一节都会分化出侧枝),少侧枝(侧枝集中分布在个别节位)和无侧枝类型。无侧枝品种S61和有侧枝品种S06的杂交试验中,其F_2代有侧枝与无侧枝的比例符合孟德尔遗传的3:1规律,说明黄瓜的无侧枝性状很可能和拟南芥的ls突变体一样,是由于单个基因的隐性突变造成,而且是一个未知的控制黄瓜分枝的遗传位点。而部分多侧枝品种则可以通过与少侧枝品种嫁接恢复为少侧枝的性状,说明黄瓜分枝也受到一种可以嫁接转移的信号物质的调控,这种物质很可能是最近发现的类胡萝卜素裂解超加氧酶家族成员。为了证实我们的想法,利用不同分枝材料的黄瓜品种作了嫁接试验,结果显示黄瓜的侧枝发育至少受到两种信号通路的控制,从另一个侧面说明S61的无侧枝性状与嫁接转移信号无关,可能是侧生分生组织起始缺陷造成的。番茄ls突变体同样没有侧枝形成,而且ls基因是最早影响侧芽发育的基因之一。由此根据番茄、拟南芥和水稻的侧枝抑制基因序列。同源克隆黄瓜的侧枝抑制基因cls,得到其全长2175 bp的cDNA序列,以及包含一个716bp内含子的基因组序列。Southern杂交显示,在黄瓜基因组中cls基因为单拷贝。同源分析表明,黄瓜cls基因与番茄侧枝抑制基因ls在氨基酸水平上有67%的同源性,也属于GRAS转录因子家族,包含GRAS基因家族标志性的5个结构域:亮氨酸重复域Ⅰ,VHHID结构域,亮氨酸重复域Ⅱ,PFYRE结构域,以及SAW结构域。亚细胞定位显示,CLS转录本主要集中在核中,更加说明了CLS是作为转录因子来行使功能的。表达谱分析显示,CLS的转录本主要集中在顶芽、雄花、根中。为了更详细地了解CLS在侧生分生组织起始和侧芽形成中的作用,取多侧枝品种S06十天苗龄的顶芽固定后做RNA原位杂交。在任何内眼可见的形态变化之前,在腋生分生组织区域有高表达的CLS信号,而在顶端分生组织则检测不到CLS信号。这些结果暗示CLS在侧生分生组织起始和侧芽形成中起到了关键作用。在拟南芥的转化试验中,无侧枝的ls突变体在转入cls基因后,能恢复野生型侧枝的表型,长出侧枝。说明了cls基因在侧枝发育中有重要的作用,而且这个基因在不同物种的保守性非常强。……