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构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞

唐南洪;王晓茜;李秀金;陈燕凌

  目的:构建具有降氨功能的特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞。方法:设计引物,克隆人谷氨酰胺合成酶(hGS)基因及人甲胎蛋白(AFP)转录调控元件(TREs)(含增强子和启动子片段):构建真核表达载体 pLNChGS;并将 pLNChGS 载体上 CMV 启动子序列删除,插入人 AFP TREs,构建真核表达载体 pLNAFhGS;进行菌落 PCR、酶切及 DNA 测序鉴定;转染 PA317细胞,获得重组逆转录病毒, 并感染 HepG2细胞,得到阳性细胞克隆分别为 HepG2/pLNCX、HepG2/pLNChGS 和 HepG2/pLNAFhGS;MTT 法检测细胞增殖,进行 hGS mRNA RT-PCR 半定量分析,以及细胞 hGS 酶活性检测。结果:四种细胞生长增殖变化不明显;与对照细胞相比,HepG2/pLNChGS、HepG2/pLNAFhGS 细胞的 hGS mRNA 呈高水平表达(p<0.001), 而 HepG2/pLNAFhGS 细胞 mRNA 的表达高于 HepG2/pLNChGS,差异有统计学意义(p<0.001);与对照细胞相比,HepG2/pLNChGS、HepG2/pLNAFhGS 细胞的 hGS 酶活性较高(p<0.05),而 HepG2/pLNAFhGS 细胞的 hGS 酶活性高于 HepG2/pLNChGS 细胞,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:成功构建了特异高表达 hGS 的肝细胞,为进一步降氨毒功能的研究打下基础。……