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畜牧与动物医学
环丙沙星特异性抗体的制备及ELISA方法的建立
环丙沙星为第二代氟喹诺酮类抗生素,因其具有广谱的抗菌活性及良好的药物动力学特点,被广泛用于兽医临床和畜牧生产,治疗动物疾病和作为饲料添加剂使用。但由于盲目及不合理应用,导致了相应耐药菌株的出现,进而影响药物疗效,且其在动物组织内的残留经食物链进入人体后,会对人体的健康造成威胁。许多国家(包括中国)都已对其在畜牧生产中的使用作了休药期,并制定了畜产品中环丙沙星的最高残留限量标准。为了监测畜产品中环丙沙星的残留,急需建立快速检测方法。 ELISA凭借快速、灵敏的优点,成为普遍应用于兽药残留分析的筛选方法,本研究的目的是制备环丙沙星特异性抗体,进而开发动物性食品中环丙沙星残留检测试剂盒,应用于进出口及国内动物性食品质量监测,保障动物性产品安全,从而取得良好的社会、经济效益。 ELISA技术的关键是抗体的制备,由于环丙沙星为小分子半抗原,无免疫原性,且其本身不能为固相载体所吸附,因而在建立ELISA分析法时,需制备人工完全抗原。已报道的环丙沙星免疫原合成方法均应用环丙沙星的羧基直接与载体蛋白的氨基进行偶联,本研究改进了这一方法,在免疫抗原合成采用乙二胺阳离子化蛋白作为载体,进而与环丙沙星偶联,分子结合比为20:1,免疫兔子获得了高特异性的抗血清,2号兔的IC50达1ng/mL;在此基础上,进一步尝试以己二胺化BSA为载体制备免疫抗原,分子结合比为17:1,尝试通过改变免疫原间隔臂长度获得特异性更高的抗体,并与第一种方法制备乙二胺化抗原同时免疫小鼠,对比免疫效果,结果得到预期试验效果,己二胺化抗原得到的抗血清灵敏度及特异性整体提高,其中4号小鼠血清的IC50达0.1ng/mL,说明抗原间隔臂的长度对免疫系统对半抗原的识别有重要影响。 在对所获特异性抗体的效价、特异性等进行分析的基础上,选择了2号兔抗血清用于建立环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法。 利用优化后的试验条件进行间接竞争ELISA检测并建立标准曲线,标准曲线的回归方程为y=-13.139x+51.3,相关系数R2=0.998,最低检测限0.01ng/mL,线性检测范围0.01~10 ng/mL。分别以鸡肉、鸡肝、鸡蛋为基质添加标准环丙沙星后进行检测,其平均回收率分别为76.95%、79.38%、79.80%。
硕士论文
《中国农业科学院》 2010年硕士论文

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