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畜牧与动物医学
猪瘟病毒SPA协同凝集试验及双夹心ELISA检测方法的建立
本研究通过PK-15细胞增殖猪瘟石门系强毒F_(114)株(CSFV-F_(114)),通过制备犊牛睾丸细胞增殖猪瘟中国兔化弱毒C株(HCLV)。HCLV株病毒液经反复冻融后利用聚乙二醇6000浓缩并纯化,得到纯度较高的HCLV。将浓缩纯化的病毒液分别免疫家兔和猪,制备了兔抗HCLV及猪抗HCLV的高免血清,经饱和硫酸铵沉淀、透析除盐后,获得了兔抗HCLV及猪抗HCLV免疫球蛋白IgG的粗提物。 依据金黄色葡萄球菌细胞壁上的A蛋白(SPA)的特性,用富含A蛋白的金黄色葡萄球菌国际标准株(Cowan I)标记兔抗HCLV及猪抗HCLV高免血清,建立了诊断猪瘟的SPA平板协同凝集试验。用不同稀释度的抗血清制备SPA诊断液进行协同凝集试验,兔抗HCLV原倍血清,猪抗HCLV阳性血清2倍稀释所得诊断液效果最理想。对两种血清标记的SPA诊断液的灵敏度进行对比,兔抗HCLV SPA诊断液抗原的最高检出浓度为:1∶32,猪抗HCLV SPA诊断液抗原的最高检出浓度为:1∶64。与对流免疫电泳检测到1∶2倍稀释的抗原相比,该方法敏感性较高。通过对发病动物各脏器灵敏度的检测,证明在临床运用SPA协同凝集法检测猪瘟的诊断中淋巴结和脾脏为最佳检测部位。此外,该操作简便、快速,节省材料,无需特殊仪器,是一种适用于基层猪场对猪瘟的快速诊断和流行病学调查的新技术。 利用兔抗HCLV IgG,猪抗HCLV IgG及羊抗兔酶标抗体,建立了双夹心ELISA用于检测CSFV抗原的免疫学方法。试验确定的兔抗HCLV IgG,猪抗HCLV IgG及酶标抗体的最佳使用浓度分别为1∶40,1∶200,1∶400。经敏感性试验、特异性阻断及交叉试验、重复性试验,结果表明该检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点。是一种适用于实验室确诊猪瘟病毒的方法。 应用本研究建立的两种检测CSFV抗原的方法对50例临床样本进行了检测。SPA协同凝集试验检出阳性样本6份,阳性检出率12%,4~7min内即可观察到结果;双夹心ELISA检出阳性样本10份,阳性检出率20%,所需时间约24h。
硕士论文
《河北农业大学》 2006年硕士论文

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