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畜牧与动物医学
磺胺甲噁唑单抗制备及胶体金免疫层析试纸条的研制
磺胺甲噁唑(SMZ),在兽医临床上主要用于呼吸道和泌尿道感染的治疗,具有抗菌谱广、疗效确切、性质稳定、使用方便、价格低廉等诸多优点。但不合理的用药,可导致磺胺类药物在可食用动物组织中的残留,对食品安全和人类健康造成危害。有必要建立一系列有效的方法,以满足不同条件下动物性食品中SMZ残留的检测。目前,SMZ残留的检测方法主要有,微生物法、色谱技术、免疫学分析法。为探索并建立一种能够简单、快速、适量检测SMZ残留的方法,本研究在利用杂交瘤技术制备了灵敏度高、特异性强、效价高的单抗,在建立动物性食品中SMZ残留的ELISA测定方法基础上研制了SMZ金标检测试纸条。 1、SMZ全抗原的合成。磺胺甲噁唑属于半抗原,分别用重氮法、戊二醛法和碳二亚胺法制备SMZ与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和人血清白蛋白(HSA)的完全抗原,作为包被原和免疫原。完全抗原SMZ-BSA, SMZ-OVA和SMZ-HSA纯化后通过紫外扫描进行检测,确认SMZ已经偶联到蛋白上。并计算出药物SMZ和载体蛋白BSA、OVA和HSA分子结合比为23.3:1、17.7:1和24.5:1。 2、SMZ单抗的制备。用重氮法合成的完全抗原SMZ-BSA免疫7周龄BALB/C小鼠,利用单克隆抗体技术和现代细胞融合技术获得一株可持续分泌针对药物SMZ抗体的杂交瘤细胞株1C5,将细胞株1C5接种到小鼠体内,采用诱生腹水法制备了抗SMZ的腹水,其蛋白浓度为24.9mg/mL,效价达1:80000以上,SMZ药物竞争抑制标准曲线方程为y=0.3068x+0.0824(R2=0.9955),IC50为22.9ng/mL, LOD为1.02ng/mL, LOQ为5.39ng/mL。交叉实验表明,SMZ抗体对磺胺喹噁啉(SQ)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺噻唑(ST)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM')、磺胺醋酰(SA)等7种药物均无交叉反应。 3、SMZ胶体金免疫层析试纸条研制。实验采用柠檬酸三钠还原法制25nm胶体金,鉴定质量后,标记单克隆抗体。将金标抗体喷涂在Ahlstrom8964玻璃纤维素上,特异性抗原包被在Millipore135硝酸纤维素膜上,制成快速检测试纸条。并对SMZ胶体金免疫层析试纸条的各项指标进行优化,并确定了最佳条件,成功建立胶体金免疫层析检测SMZ残留的方法。使用试纸条对SMZ标准液检测,检测限为100ng/mL。交叉实验表明,试纸条对SQ、SD、SMD、ST、SDM'、SA等6种药物均无交叉反应。 4、SMZ添加回收实验。本研究对应用磺胺甲噁唑较多的动物性食品进行了添加回收试验。用ELISA方法测得在牛奶中药物添加回收率为92.4%~112.6%,在鸡蛋中的添加回收率分别为86.9%~128.2%,在鸡肉中的添加回收率为68.4%~84.5%。并用试纸条检测处理样品进行验证,鸡肉样品的检测准确率为91.7%,鸡蛋样品检测准确率为87.5%,鸡肉样品检测准确率为83.3%。结果表明试纸条能够基本满足检测要求。 本实验建立的对动物性食品中磺胺甲噁唑残留的ELISA检测和GICA检测方法,方便、快速、准确,适用于对SMZ残留的快速检测,本研究也为其他兽药残留检测方法的研究提供借鉴。
硕士论文
《扬州大学》 2010年硕士论文

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