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畜牧与动物医学
荣昌猪、内江猪白细胞介素-10基因的克隆与原核表达研究
本试验根据GenBank上发表的猪IL-10(interleukin-10,IL-10)基因序列(登陆号:L20001)设计并合成了特异性引物,经ConA(刀豆蛋白素A)诱导的荣昌猪、内江猪外周血单核淋巴细胞(PMBC),并提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出两条为771bp的目的片段,并将其克隆到PMD18-T载体上,经酶切鉴定和序列测定证明该两条序列分别为荣昌猪、内江猪IL-10。开放阅读框由528个核苷酸组成,推测产生的编码产物由175个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现,荣昌猪IL-10与内江猪IL-10之间的核苷酸同源性为99.2%,两个地方品种猪的IL-10与GenBank已发表的IL-10序列的同源性较高,都为99.6%,荣昌猪与内江猪间IL-10氨基酸的同源性为98.7%。 设计一对引物亚克隆荣昌猪IL-10成熟蛋白编码基因(477bp),利用基因重组技术构建了PET32a(+)—PIL-10融合表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用1mM的IPTG进行诱导表达重组荣昌猪IL-10蛋白。SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约为38kD(融合蛋白)处有明显的蛋白质表达条带,而未经诱导的PET-32a(+)-IL10在38 kD处无条带产生,光密度扫描结果显示,诱导四小时后,表达蛋白条带约占菌体总蛋白的48.5%。免疫印迹试验证实重组蛋白可以被组氨酸特异性单抗所识别,表明重组蛋白以带有组氨酸标签的融合蛋白形式表达。最后洗涤表达的IL—10融合蛋白包涵体并用MTT法检测其生物学活性。通过t检验分析表明所获得的重组猪IL-10具有较高的促猪外周血淋巴母细胞增殖反应活性,具有较强的生物学活性。 本试验首次克隆出地方猪种—荣昌猪、内江猪IL-10基因,并通过对基因序列改造后经原核表达出荣昌猪IL-10融合蛋白,这为进一步研究地方猪种IL-10在体内外的作用,并为研究其生理活性及在疾病和疫苗免疫中的作用提供了条件,同时对地方猪种IL-10的深入研究,可以为地方猪种作为免疫移植的供体提供参考。
硕士论文
《四川农业大学》 2007年硕士论文

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