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畜牧与动物医学
天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究
我国是水禽生产大国,天府肉鹅具有良好的遗传特性,在整个西南地区的占有率很高,养殖规模较大,社会和经济效益显著。随着集约化养鹅业的发展,研究开发出能有效增强鹅疫苗的免疫力和对鹅病毒具有抑制或杀灭作用的生物制剂,对鹅病的有效防治具有重要的意义。IFN-α干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能。本研究采用基因工程及相关技术,借鉴相关研究,对天府肉鹅IFN-α(tf-GoIFNα)进行克隆、表达及其功能与应用研究。 1天府肉鹅干扰素-α基因的克隆及生物信息学分析 采用RT-PCR法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增出其IFN-α基因(tf-GoIFNα);并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对tf-GoIFNα基因的核酸及氨基酸序列进行分析,同时分析13个与其相关的基因序列的相似性及进化情况。实验结果表明,tf-GoIFNα克隆成功,完整的ORF基因全长576个核苷酸,编码191个氨基酸,表达蛋白分子质量为21670.7Da,潜在的信号肽切割部位位于第28位的A(丙氨酸)和第29位的F(苯丙氨酸)氨基酸之间,二级结构主要由0-螺旋(H)和无规则卷曲组成,大致包括10个抗原表位;tf-GoIFNα基因编码的氨基酸序列含有2个潜在的N-糖基化位点,9个潜在的O-糖基化位点,含有5个潜在的磷酸化位点,第一个疏水区同信号肽位置一致,提示信号肽引导蛋白分泌到胞外作用,没有跨膜区,亚细胞定位预测,tf-GoIFNα表达的蛋白大约会有55.6%在细胞外,22.2%在细胞质,l 1.1%在线粒体,11.1%在细胞核;序列分析及比较结果显示tf-GoIFNα与同类的水禽(鸭、鹅)有90%之上的相似性,在进化树中位于同一分支。与狮头鹅的同源性最近,其中核酸相似性达到99.3%,氨基酸相似性达到97.9%;基因密码子特征分析表明,本研究所克隆的tf-GoIFNα为高表达、密码子偏性较高的基因,其密码子偏爱性情况与鸭IFN-α相近,与鸡IFN-α基因的密码子偏爱性有所不同,提示可以参照和借鉴已经开展的鸭IFN-α基因的表达,开展tf-GoIFN-α的表达及进一步的深入研究。 2 tf-GoIFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测 参照已克隆的tf-GoIFNα完整ORF基因序列设计引物,克隆到了成熟肽基因,基因全长486bp。将成熟肽基因与原核表达载体pET32a连接,构建原核表达载体pET32-mtf-GoIFN-α,并于表达菌Rosetta中表达,成功表达大小为38kDa的蛋白。表达蛋白经过Ni-IMAC亲和层析纯化以及稀释透析复性后,SDS-PAGE显示蛋白己纯化为单一条带。采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性,纯化复性的重组质粒pET32-mtf-GoIFN-α表达蛋白抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5×103U/mmg。并且在GEF和DEF中检测到鹅IFN-α重组蛋白抗VSV效果是一致的。SYBR Green real-time PCR检测,复性后的tf-GoIFNα重组蛋白进行抗GPV,IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显著性差异(P<0.05),tf-GoIFNα重组蛋白具有抗GPV的活性作用,对GPV病毒的相对抑制率达89.4%。 3鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 为了研究兔抗鹅IgG酶标抗体的制备,试验采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提,透析除盐,DEAE50纤维素层析相结合的方法提取鹅卵黄IgG,经核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG浓度,制备兔抗鹅IgG酶标抗体。结果表明:粗提的IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度可达到94.5%;免疫扩散得出兔抗鹅IgG抗血清效价约1:32,抗体酶标后效价为1:3000,具有应用价值。 4 tf-GoIFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 为了进一步研究tf-GoIFNα基因的特性和功能,将tf-GoIFNα基因克隆到pcDNA3.1-(+)真核表达载体上,构建重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α,脂质体介导将其转入COS-7细胞,应用间接免疫荧光、ELISA和Western-blot法检测GoIFN-α基因在COS-7细胞中的转录和表达情况,并对COS-7细胞表达上清液进行抗病毒活性检测。结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-GoIFN-α构建成功,目的蛋白在转染12h后就可以被检测出,36h前目的蛋白在上清液中快速增加,之后增加速度变慢;重组质粒能够在COS-7细胞内得到高效表达,表达的蛋白分子量为38kDa,比预测的分子质量(约21kDaA)大;间接免疫荧光显示,tf-GoIFNα基因产物由细胞核向细胞浆发散;表达产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及小鹅瘟病毒(GPV)的活性。 5tf-GoIFN-α真核表达质粒对GPV-VP3基因疫苗的免疫佐剂效应 为检测tf-GoIFN-α真核表达质粒(pcDNA-GoIFN-α)对GPV-VP3基因疫苗的佐剂作用,将pcDNA-GoIFN-α以每只50、100、200μg三个剂量与GPV-VP3基因疫苗一起用肌肉注射法分别免疫28日龄鹅,同时设分子佐剂gIL2对照组、分子佐剂GoIFN-α与gIL2联合免疫佐剂组、空载体质粒pcDNA3.1(+)对照组、小鹅瘟弱毒对照组和空白对照组,接种后第3、7、14、21、28、35、49d采抗凝血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鹅外周血T淋巴细胞转化;第3、7、14、21、28、35、49、63、77 d采凝血用间接ELISA法以及中和试验检测血清抗体水平。结果显示: (])淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值)pcDNA-GoIFN-a以不同剂量与GPV-VP3基因疫苗一起免疫鹅后,各实验组的T淋巴细胞增殖反应在第3d基本维持同一水平,从第3d到第28d稳步上升,在28 d达到了最高峰,而pcDNA-VP3免疫组在第35d达到高峰。在第28d,佐剂组的OD值均极显著(P≤0.01)高于pcDNA-VP3基因疫苗组、GPV弱毒组、pcDNA3.1 (+)和生理盐水对照组。GoIFN-α佐剂组只在第21d显著(P<0.05)高于gIL2佐剂组,其他时间点差异不显著。联合佐剂组在第14d、第28d到第49d均显著高于GoIFN-α或gIL2佐剂组(P<0.05)。 (2)外周血抗体IgG水平(OD值)佐剂免疫组的ELISA抗体水平从第3d的增长趋势为先慢后快,至第35d到达最大值,之后逐渐下降,但仍明显高于pcDNA-VP3基因疫苗组和GPV弱毒组。gIL2佐剂组在第28d到第42d和63d到第77d显著高于GoIFN-α佐剂免疫组(P≤0.05),GoIFN-α和gIL2联合佐剂免疫组在第21d到第77d极显著高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂免疫组(P≤0.01)。在GoIFN-α佐剂组中,佐剂作用呈一定的剂量相关性。 (3)外周血中和抗体效价在免疫后第60d和第75d,GoIFN-α/gIL2联合佐剂组极显著(P≤0.01)高于GoIFN-α或gIL2佐剂组(表8-5)。佐剂组的中和抗体效价在第45d到第75d期间均显著(P≤0.05)或极显著(P<0.01)高于pcDNA-VP3组。GPV弱毒组在第45d显著高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂组诱导的中和抗体水平(P≤0.05),与GoIFN-α和gIL2联合佐剂组所诱导的中和抗体水平差异不显著。整个检测过程中,注射pcDNA3.1(+)和生理盐水的鹅对照血清不能保护细胞对抗病毒的感染。 实验证明,pcDNA-GoIFN-α能使GPV-VP3基因疫苗诱导的T淋巴细胞转化能力增强,血清抗体IgG水平和中和抗体效价升高,是一种良好的增强GPVVP3基因疫苗的分子佐剂,分子佐剂goIFN-α和golL2联合免疫组效果最佳,pcDNA-goIFN-α肌肉注射200μg/只的效果次之。 6 tf-GoIFNα在毕赤酵母中的分泌表达及其活性检测 为了更好的利用基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂,应用PCR技术从含有tf-GoIFNα完整ORF的重组质粒pMD18-T-GoIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因,亚克隆于穿梭载体pPICZαA上,构建重组酵母表达质粒pPICZαA-GoIFN-α;重组质粒经sacⅠ线性化后,电转化入酵母表达菌X33;1%的甲醇诱导表达3株不同的菌72小时后,斑点杂交筛选出高拷贝的转化子,Elisa法鉴定筛选最佳表达时间和甲醇浓度。重组子经诱导表达,TCA浓缩后,SDS-PAGE和Western-blot分析,并采用微量细胞病变抑制法分析研究其生物活性。结果表明,成功构建了重组鹅IFN-α的酵母表达质粒,并实现了其在毕赤酵母中的分泌表达;SDS-PAGE和Western-blot分析显示获得分子量约为22kDa的表达蛋白,比预测的蛋白分子量(18.7kDa)略大,估计是糖基化的原因;表达产物对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/mL。
博士论文
《四川农业大学》 2011年博士论文

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