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生物学
含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶性质研究
所有四吡咯化合物如血红素、叶绿素和维生素B12等对大部分生物体有非常重要的作用,它们合成的第一个共有底物是5-氨基酮戊酸。共有反应的第一步是两分子的5-氨基酮戊酸缩合成一分子的胆色素原,由5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydratase,ALAD),又名胆色素原合酶的酶所催化。 已从数个物种中纯化了ALAD,它是一个金属蛋白,不同生物中的ALAD依赖不同的金属离子。在微生物和哺乳动物中,ALAD是同源八聚体,在植物中是六聚体。已从近百个物种中克隆了ALAD的基因,所有物种的ALAD的氨基酸序列比对显示有约35%的同源性。利用重组技术定点突变确定了数个物种ALAD起催化作用的必需氨基酸残基。数个物种的ALAD的晶体结构显示酶活中心高度保守。枯草杆菌的ALAD基因和大肠杆菌的基因高度保守,但枯草杆菌的ALAD酶活中心的保守氨基酸序列和大肠杆菌略有不同。迄今未有枯草杆菌ALAD性质的报道。ALAD催化合成的产物PBG,不仅可以用于后续的酶活分析,而且也是癌症药物的前体。 本实验从枯草杆菌克隆ALAD基因,在大肠杆菌中表达并测定其酶学性质,研究内容及结果如下: 1.重组枯草杆菌ALAD表达载体的构建 以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR方法扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因(hemB)。测序结果和报道的枯草杆菌hemB序列一致。将Nde I和EcoR I双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28a中构建成表达载体。 2.5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达与一步纯化 构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃,0.5 mmol/L的IPTG下诱导5 h,重组蛋白获得高效表达。SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为164 U·mg-1,表明酶以活性形式表达,组氨酸标签不显著影响酶活。利用ALAD加在N端的组氨酸标签,通过Ni-NTA进行纯化,SDS-PAGE表明可纯化至均一。 3.5-氨基酮戊酸脱水酶的酶学性质 枯草杆菌ALAD的酶的亚基分子质量约为41 kDa,全酶分子量为330 kDa,表明酶由8个同亚基寡蛋白组成;最适pH为8.0;动力学参数Km为7.4 mmol,Vmax为0.54 mmol·h-1;在55℃温浴10 min,保留85%的酶活,表明热稳定性较好;添加金属离子如K+、Zn2+、Mg2+、Li+、Fe3+和Mn2+都显著地增加了酶活力,最高达将近200%,Cu2+和Hg2+却显著地抑制了酶活。随β-巯基乙醇浓度的增加至10 mmol/L,酶活随之增加,β-巯基乙醇保护催化产物免于氧化。高浓度的还原剂二硫苏糖醇抑制酶活,推测它影响酶活中心半胱氨酸和金属离子的结合。数个氨基酸修饰剂的修饰结果表明,赖氨酸和半胱氨酸残基是酶催化必需的,而组氨酸和丝氨酸残基修饰仍然有一定酶活,主要是修饰剂改变了酶的空间结构。
硕士论文
《安徽农业大学》 2006年硕士论文

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