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食品中甾体激素残留免疫分析技术与方法研究
19-去甲基睾酮(19-nortestosterone,19-NT),是一种合成甾体激素,由于具有雄激素样作用,常被非法用作动物生长促进剂。一旦使用该激素,动物的肝、肾和其它部位就会有残留存在,人食用后可产生一系列激素样作用,破坏人体内的激素平衡、干扰人的内分泌功能、影响人的生育能力、并对人体具有潜在致癌性。因此本研究以19-去甲基睾酮为研究对象,建立了相应的ELISA酶联免疫分析技术、胶体金快速检测技术和分子印迹技术,确保了能对19-去甲基睾酮进行准确、快速、高灵敏度检测。 由于19-去甲基睾酮是小分子,不具有免疫原性。只能将19-去甲基睾酮分别与牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)和卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)偶联后才能分别作为免疫原和包被原。首先将19-NT肟化,然后通过混合酸酐法合成了19-NT人工抗原。免疫6只小鼠,通过粗测抑制率,6号小鼠结果最好。选择6号做细胞融合,共分装4块96孔板。通过筛选,扩大培养和克隆化得到1A3和3B2这2株能稳定分泌19-NT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中3B2的IC5o略好于1A3,IC5o不超过3.0。将3B2单克隆抗体大量制备及纯化,测得亲和性常数为8.42×1010L/mol,且特异性非常好,对结构类似物几乎没有反应性,经鉴定亚类为IgGI型。 制备了19-NT单抗-HRP偶联物。经鉴定,酶标记率为0.8797,酶标抗体效价为1:12800。建立了直接竞争ELISA检测方法,IC50为2.9ng/mL,批间差和批内差都小于10%,具有较好的稳定性。通过加速稳定性实验,预测该ELISA试剂盒在常温24度下至少可以稳定保存6个月。经过特异性、准确性、稳定性等指标的评估,该ELISA检测方法具有良好的性能,完全能满足批量检测的需要。 选用20nm左右的胶体金纳米粒子标记19-NT抗体,标记pH为8.6,标记浓度为7.2μg(抗体)/mL(金)。通过优化实验,最佳T线浓度为0.3mg/mL,最佳C线浓度为0.5mg/mL,样品检测pH应调节在7.0~8.0区域,样品中有机溶剂含量应控制在30%以下,样品中的离子强度应控制在0.1mol/L以下。用试纸条检测19-NT标准溶液,检测限为5ng/mL。通过加速稳定性实验,可以预测该金标试纸条在常温24度下至少可以稳定5个月 以1mmol 19-NT为模板分子,4mmol甲基丙烯酸为功能单体,10mmol TRIM为交联剂,用沉淀聚合法制备分子印迹聚合物微球(MIPs),60℃反应24h,得到分子印迹聚合物微球。经过鉴定,其粒径比较均一,比表面积为40.2421 m2/g,孔径约为20.3nm。对19-NT的最大表观结合量为94.882μmol/g,识别因子β值高达27.26,对模板分子显示出最强的结合能力与特异性识别能力。对MIP-SPE洗脱条件进行优化,使用10%甲醇的纯水淋洗液,选择甲醇/乙酸(9:1,V/V)为洗脱液为好,使用4mL洗脱液时,几乎所有被吸附的19-NT分子都能被洗脱下来。而且MIP-SPE第11次使用时,平均回收率还能达到85%以上,整个过程中CV值均小于5%。通过优化MIP色谱柱的使用条件,最终得到MIP柱对19-NT的线性方程为y=0.4188X-4.5569,R2=0.9983,而且具有较好的富集效果,浓缩倍数达到48倍。因此,19-NT-MIP完全满足固相萃取的应用要求,从而为HPLC, ELISA,胶体金试纸条检测技术提供了快速有效的样品前处理手段。
机 构:
领 域:
博士论文
《江南大学》 2010年博士论文

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