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中药学
参志苓片通过抑制microRNA-1281表达靶向ADCY1/DVL1发挥抗抑郁作用
目的:参志苓是经典抗抑郁古方开心散的中药成药制剂,本研究旨在基于其临床疗效在转录后水平阐明参志苓抗抑郁的分子作用机制和相关生物学途径。方法:采集"参志苓片随机、双盲双模拟、阳性药平行对照治疗轻/中度抑郁症的有效性和安全性临床试验"受试者的参志苓治疗8周显效血清样本,并匹配健康对照,通过生物信息学分析筛选出在血清中差异表达的miRNAs,并遴选目标miRNAs进行RT-PCR验证。基于miRNAs表达谱中发现新的分子靶标miR-1281,建立皮质酮损伤体外模拟抑郁细胞模型并予以不同浓度开心散处理,以考察miR-1281及其预测的靶基因在神经细胞中的表达情况及开心散的干预作用;通过双萤光素酶报告基因的方法分别检测miR-1281对野生型/突变型ADCY1和DVL1的降解能力,验证miR-1281对ADCY1和DVL1的靶向调控作用;构建miR-1281过表达的慢病毒表达载体,并予以不同浓度开心散处理,采用CCK8法、流式细胞术、PCR等方法,研究miR-1281表达水平的变化对神经细胞增殖、凋亡等细胞表型以及靶基因的影响;采用western blot检测miR-1281过表达对c AMP/PKA/ERK/CREB和Wnt/β-catenin信号转导通路靶蛋白的影响。结果:在抑郁患者中共鉴定出112个差异具有显著性的mi RNAs,在参志苓给药8周后共鉴定出46个差异具有显著性的miRNAs。两者取交集,共有45个miRNAs表达差异显著,其中17个上调,28个下调,既可能是抑郁症发病的生物标记物,又可能是参志苓抗抑郁的作用靶标。随后验证出交集中10个差异表达的候选目标miRNAs,其中miR-1281在抑郁患者中高表达,而在参志苓给药后下调,且microRNA-gene-pathway-net分析显示miR-1281网络赋值较高进一步细胞功能学实验显示,皮质酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中miR-1281表达水平升高,而其预测的靶基因ADCY1和DVL1表达水平降低,开心散干预后呈剂量相关性同时反向减低/升高。转染突变型ADCY1和DVL1质粒组的HEK293细胞内ADCY1和DVL1的水平明显高于野生型质粒组,说明野生型ADCY1和DVL1可与miR-1281特异性结合并被降解,ADCY1和DVL1可能是miR-1281的靶基因。转染miR-1281慢病毒后SH-SY5Y细胞存活率降低并凋亡明显,开心散干预后存活率显著增加,并明显抑制细胞早期凋亡。同时在mi R-1281过表达的SH-SY5Y细胞系中,ADCY1mRNA和DVL1mRNA表达水平下调,由ADCY1介导的cAMP信号通路上的关键蛋白水平明显降低,开心散干预后蛋白水平呈剂量相关性显著性增高,而由DVL1介导的Wnt信号通路上的GSK-3β蛋白表达水平增高,p GSK-3β和β-catenin蛋白表达水平降低。结论:基于RCT临床研究的外周血样本开展了经典古方开心散成药-参志苓片的转录后调控研究,筛选并验证了与抑郁发生和参志苓抗抑郁作用相关的差异miRNAs,发现了miR-1281是在外周临床样本中被鉴定出来的一种新的可能与抑郁和参志苓抗抑郁作用相关的微小RNA。通过体外研究阐明了过表达miR-1281对神经细胞具有损伤作用,开心散可能通过下调miR-1281水平同时靶向ADCY1和DVL1,从而激活cAMP/PKA/ERK/CREB和Wnt/β-catenin信号转导通路来发挥神经细胞保护作用。
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2019中国中西医结合学会临床药理与毒理专业委员会第三届学术研讨会论文摘要集
2019年

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