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中药学
乌头碱对心肌细胞毒与效转换的作用途径
目的:乌头碱既是附子发挥强心作用的有效成分,也是附子诱发毒性反应的主要成分。本文研究乌头碱对心肌细胞线粒体结构与功能的影响,旨在阐明乌头碱毒与效转换的作用途径。方法:用CCK-8方法检测乌头碱对细胞存活率的影响。流式细胞仪检测线粒体膜电位、活性氧(ROS)生成量的变化;使用相应的荧光探针,结合激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内Ca~(2+)、线粒体内Ca~(2+)以及线粒体内超氧化物的变化。用q RT-PCR和Western-blot技术检测乌头碱对线粒体相关基因和蛋白的影响;用Seahorse技术检测乌头碱对线粒体氧化磷酸化能力的影响。结果:高剂量(1-10μM)乌头碱处理心肌细胞后能够引起心肌细胞钙瞬变的频率增加以及相对Ca~(2+)含量升高,从而导致心肌细胞内钙紊乱,这种作用能够被维拉帕米(钙通道阻滞剂)及KN93(CaMKⅡ抑制剂)所抑制。乌头碱能够引起肌浆网上的钙通道Ry R2m RNA转录水平的增加,引起CaMKⅡ磷酸化水平和Ry R2蛋白表达水平升高;乌头碱对心肌细胞进行刺激后,ANP在m RNA水平及蛋白水平的表达均上调;Ca N蛋白表达水平升高,c-NFAT3蛋白表达水平下降,n-NFAT3蛋白表达水平升高。低剂量(5-20 nM)乌头碱能够保护线粒体超微结构,改善线粒体空泡化和嵴断裂的现象;同时能够维持线粒体膜电位的稳定,抑制MPTP的持续性开放,促进ATP的合成。乌头碱通过激活Sirt3的活性,减轻Cyp-D的乙酰化程度,进而减少Cyp-D与ANT的结合,减少MPTP的持续性开放。Sirt3基因敲除后,乌头碱对线粒体功能的保护作用消失。线粒体氧化磷酸化检测结果显示乌头碱能够剂量依赖性的增强H9c2细胞的氧化磷酸化能力,促进线粒体呼吸链相关蛋白的表达;乌头碱的心肌保护作用在体内水平进一步得到验证,乌头碱组的cTn、CK、AST、LDH水平与TAC组相比明显降低,尤以高剂量组最为明显;心脏病理学检测结果表明TAC组心肌组织的肿胀、变性,肌纤维排列异常,出现溶解、断裂现象。乌头碱处理组其心肌组织病变显著减轻,肌纤维排列规整,溶解和断裂现象得到明显改善。结论:乌头碱在高剂量时可明显造成心肌细胞钙离子紊乱,出现钙瞬变现象。低剂量乌头碱通过激活Sirt3的活性,减轻Cyp-D的乙酰化程度,进而减少Cyp-D与ANT的结合,减少MPTP的持续性开放,改善线粒体能量代谢。
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2019中国中西医结合学会临床药理与毒理专业委员会第三届学术研讨会论文摘要集
2019年

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