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多西环素残留免疫学快速检测技术研究

乐涛

   多西环素(Doxycycline, DOX)为四环素类抗生素(Tetracycline, TCs),通常用来治疗动物传染病,还被用作饲料添加剂,以预防疾病和促进动物生长。在实际工作中,由于随意加大使用剂量和不遵守休药期,造成药物在动物组织中残留。四环素类药物长期残留在动物组织中,导致耐药菌在人类之间传播,严重损害人体健康。很多国家和国际组织通过建立动物性食品中兽药残留的有效检测方法,来控制药物残留问题。如,我国和欧盟对DOX在动物组织中残留最高残留限量(MRL)作了明确规定:肌肉、肝脏和肾脏的MRL分别为100μg/kg、300μg/kg和600μg/kg。为了控制兽药残留,保障人类健康,有必要建立一种快速、有效的残留检测方法对其残留进行监测。 现有的DOX残留检测的方法主要有液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、高效薄层色谱(HPTLC)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、流动注射、荧光法分析和时间分辨荧光光谱分析方法。虽然高效液相和质谱检测等仪器方法,在鉴定药物种类和定量分析上表现出良好的性能,但由于其操作复杂、分析费用昂贵,而不适用于对大量样品进行残留筛选。免疫分析技术以其灵敏、特异、快速、简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用。目前,仅有TCs免疫学检测技术,检测DOX免疫学检测方法很不完善,因此开发一种能快速检测DOX残留的免疫学检测方法,对其残留筛选具有重要价值。 本研究对DOX的免疫原性,人工抗原的合成、兔抗DOX多克隆抗体(Anti-DOXpAb)和抗DOX单克隆抗体(Anti-DOX mAb)制备及其特性、ELISA方法确立及其性能测定、免疫胶体金试纸条(Test-strip)的研制及其性能测定、高效液相检测方法和ELISA方法、Test-strip方法的等同性确证等进行了研究。主要研究结果如下: 1.免疫原和包被原的合成与鉴定 用重氮法和混合酸酐法合成免疫原(DOX-PABA-BSA),包被原(DOX-PABA-OVA);用赫夫曼反应和重氮法合成免疫原(DOX-BSA),包被原(DOX-OVA)。通过红外(IR)扫描、紫外扫描(UV)和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,证明免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)偶联成功,其分子结合比分别为12.3:1和5.8:1。将免疫原DOX-PABA-BSA和DOX-BSA免疫小鼠后,对鼠抗血清(DOX pAb)的进行ELISA方法检测,获得了高效价、敏感、特异的抗DOX血清,并进一步证明免疫原和包被原偶联成功。 2.抗DOX单克隆抗体和多克隆抗体的制备及免疫学特性鉴定 按照不同免疫剂量和免疫间期,用免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)免疫新西兰大白兔6只,免疫后获得了Anti-DOX pAb,来自2#免疫组的兔抗体(pAbⅡ),经间接ELISA效价测定为1:3.2×105,半数抑制浓度(IC50)为10.65μg/L,与TCs交叉反应率(CR%)较低,其中四环素(Tetracycline, TC)为2.34%,金霉素(Chlortetracycline, CTC)为1.46%,和土霉素(Oxytetracycline,OTC)为5.07%,与其它化合物无CR。 用免疫原(DOX-PABA-BSA、DOX-BSA)免疫Balb/c小鼠,应用细胞融合技术,筛选出2.3/3A6、2.1/2F8、2.1/4H10共3株杂交瘤细胞。用细胞株2.3/3A6,体内诱生腹水法制备腹水抗DOX单克隆抗体(Anti-DOX mAb)。间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养液上清和腹水的效价分别为1:1280和1:32000。竞争ELISA测得腹水中Anti-DOX mAb的IC50为36.19 gg//L,与TCs的交叉反应很低(CR<0.3%)。杂交瘤细胞染色体数目为90~101条,平均96.5条,同种型为IgG1。 3.ELISA方法的建立及性能考核 应用免疫原DOX-PABA-BSA进行免疫产生Anti-DOX pAb,建立DOX残留快速检测间接竞争ELISA方法,其检测质量性能较好,标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为2.5~80μg/L;在PBS、猪肌肉和猪肝脏基质中,ELISA方法的IC50分别为10.65μμg/L、16.46μg/kg(μg/L)和16.99μg/kg(μg/L),结果表明建立的ELISA方法受基质影响不大;方法在不同基质最低检测限(LOD)为:猪肌肉LOD为2.65μg/kg,猪肝脏LOD为2.96μg/kg; ic-ELISA方法能够检测范围为1.79~80μμg/L;猪肌肉的平均添加回收率分为88.24%~89.19%,猪肝为84.61%~85.54%;批内变异系数为2.60%~13.17%,批问变异系数为8.61%~11.38%,方法的重复性好于其他检测方法;Anti-DOX pAb与TC、CTC、OTC药物交叉反应率分别为2.34%、1.46%、5.07%。实验结果证明,ic-ELISA方法能够检测猪肌肉和猪肝脏样品中的DOX残留。 4.免疫胶体金试纸条的研制及性能测试 依据胶体金免疫层析技术(gold immunochromatography assay, GICA)原理,应用Anti-DOX mAb研制DOX残留快速检测免疫金标试纸条(Test-strip)。Test-strip的标准曲线呈S型,符合4参数对数曲线拟合,机读检测限为11 gg/L,目测检测限为20 gg/L;目测发现Test-strip与其他抗生素无交叉反应。 5.ELISA和金标试纸条检测方法与HPLC确证的比较 选择12头15kg左右的长大二元杂交去势健康仔猪,随机分为6组,第一组为对照组,其它5组为试验组。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料,试验组以2.5 mg/kg体重剂量的DOX注射液在仔猪颈部肌内注射,一日1次,连用4 d。给药后于0 d、3d、6d、10d、16d随机各宰杀一组猪2头,快速采集肌肉、肝样品,并进行ELISA、Test-strip和HPLC检测。用ELISA方法和HPLC方法检测组织样品,两种方法检测结果有很好的相关性。间接竞争ELISA、Test-strip和HPLC方法平行对猪肌肉和肝脏样品进行测试,检测结果3种方法有很好相关性,ELISA和Test-strip检测方法准确可靠,适合于DOX残留快速检测。 本研究首次应用Anti-DOX pAb建立ELISA方法和应用Anti-DOX mAb建立Test-strip的方法检测DOX残留,为其它兽药小分子化合物的免疫学残留分析提供了基础。该方法灵敏度高、操作简单、能同时进行大批样品的筛选,适用于猪肌肉、猪肝脏中DOX残留快速检测,能有效的监控DOX药物残留、保证动物性食品安全、避免贸易争端、扩大对外贸易、增加出口创汇及保障人类健康。……   
[关键词]:多西环素;人工抗原;多克隆抗体;单克隆抗体;酶联免疫吸附分析;免疫金标试纸;残留分析
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2010年